小麦TaAAC基因克隆及功能的初步验证

高宏欢，刘素君，姚永伟，冯健超，杜晨阳，谢迎新，王晨阳，卢红芳，马冬云

(河南农业大学农学院/国家小麦工程技术研究中心，河南郑州 450046)

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，提供人体必须的碳水化合物、蛋白质及矿质营养元素等。随着耕地面积的逐渐减少，增加产量是世界小麦生产的首要目标[1]。小麦粒重的高低受籽粒大小、灌浆充实度等因素影响[2]。在小麦籽粒内容物中，淀粉占总量的70%以上，增加淀粉合成可以有效地提高千粒重和产量[3-4]。小麦籽粒中与淀粉合成有关的多种酶和转运蛋白[5-6]影响淀粉的合成和直、支链淀粉的含量，进而影响淀粉粒的结构和淀粉理化特性。在淀粉合成途径中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)和腺苷三磷酸(ATP)反应生成ADP-葡萄糖(ADPG)和焦磷酸(PPi)，其中产物ADPG是直链淀粉、支链淀粉和植物糖原的生物合成原料[7]。AGPase是作物淀粉合成的关键酶，其活性高低显著影响淀粉含量[8-9]。小麦中AGPase分为胞质型和质体型，其中质体型为主要的存在形式[10-11]，对籽粒后期淀粉合成发挥重要作用[8]。研究表明过表达小麦AGPase的质体型小亚基基因TaAGPS1可以显著提高籽粒内AGPase酶活性和籽粒千粒重[12]。

ATP是生物体内主要的能源载体，而ATP跨膜转运是生物体能量运输的重要方式。ATP/ADP转运蛋白有两大类，一类是位于线粒体内膜，另一类是位于质体膜。质体膜的ATP/ADP转运蛋白存在于所有高等和低等植物中[13]，是一种普遍存在于质体膜上的转运载体，它能够介导细胞质中高浓度的ATP转运到质体腔内，同时专一地与质体腔内等量的ADP分子结合并转移到膜外释放[14]。因此，质体ATP的转运对ADPG形成和淀粉合成是必不可少的[15]。线粒体膜上的ATP/ADP转运蛋白将线粒体中ATP转运到细胞质，水解成为生物体直接利用的能量，同时细胞质中的ADP转运到线粒体中进行ATP再生[16]。质体与线粒体的ATP/ADP转运蛋白共同作用，维持着线粒体、质体以及细胞质三个腔中ATP浓度的平衡，为质体内的同化代谢提供能量[17]。下调表达ATP/ADP转运蛋白基因，则导致马铃薯块茎中淀粉的含量下降[18]。于林卉等[19]发现，过表达ATP/ADP转运蛋白基因，在玉米籽粒灌浆中期胚和胚乳中的表达量急剧升高。关于小麦淀粉合成的研究多集中在淀粉合成途径中相关功能基因的验证中，而小麦淀粉合成过程中与能量代谢重要相关的ATP/ADP转运蛋白基因研究较少。

本研究以小麦品种百农207为材料，克隆小麦ATP/ADP Carrier基因(TaAAC)，并以小麦GFP基因为对照，构建BSMV-VIGS-TaAAC重组表达载体，接种小麦幼穗，进一步通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，检测在小麦籽粒发育期间TaAAC基因的表达量，以初步明确小麦TaAAC基因在籽粒淀粉合成过程中的作用，并为通过转基因或分子标记辅助选择来改善小麦品质、提高粒重和产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为普通小麦品种百农207，由河南百农种业有限公司和河南华冠种业有限公司用周16/百农64选育而成，于2018年10月15日播种于河南农业大学科教示范园区，基本苗为210×104株·hm-2，管理模式同当地常规高产麦田。BSMV重组病毒载体α、β、γ和γ-GFP由本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1TaAAC基因的克隆

根据我们前期蛋白质组学的分析结果[20]，以差异蛋白ATP/ADP转运蛋白(UniProt登录号:M8A2G0)为参考序列在国际小麦基因组测序联盟数据(IWGSC,http://www.wheatgenome.org/)进行Blast，获得小麦TaAAC的cDNA(TraesCS6A02G282200.1)序列，以该序列为模板设计引物AACCDS-F:5′-AGATGGCGGACC GTGCTAA-3′和AACCDS-R:5′-TCATCATTT CCCCTCTAGGC-3′，并克隆基因的全长。扩增体系为：PrimeSTAR Max Premix(2 x)25 μL，Forward Primer(10 μM)1 μL，Reverse Primer(10 μM)1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 21 μL。PCR扩增程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，34个循环；72 ℃延伸5 min,最后维持4 ℃保存。本研究涉及的引物和测序服务均由河南尚亚生物技术有限公司完成。胶回收试剂盒和ZT4-Blunt载体由北京庄盟国际生物基因科技有限公司提供。

1.2.2TaAAC基因的生物信息学分析

利用DNAMAN软件分析TaAAC基因的测序结果，利用Pfam(https://pfam.xfam.org/search)对小麦TaAAC蛋白进行结构域分析。利用ProtComp 9.0(https://linux1.softberry.com/berry.phtml)对小麦TaAAC蛋白进行亚细胞定位分析。通过在线分析工具ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)预测TaAAC蛋白的基本理化性质。利用在线预测软件NPS-SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测TaAAC蛋白的二级结构。利用ExPASy-SWISS MODE(https://www.swissmodel.expasy.org/)预测TaAAC蛋白的三级结构。利用NCBI-BLASTP(https://blast.ncbi.n1m.nih.gov/Blast.cgi)对所克隆基因进行相似性比对和同源性分析，将比对结果输入MEGA 5.05，采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树，其中，bootstrap值设置为1 000，其余均为默认参数。

1.2.3 BSMV-VIGS-TaAAC载体的构建

根据TaAAC的CDS序列，利用Primer Primer 5.0设计引物扩增基因的沉默片段，引物序列为 AAC-F:5′-CCAGAACCAGGATGAGATG-3′和AAC-R:5′-CGAACCACTTCCAGTAACC-3′。用NheⅠ 限制性内切酶酶切γ载体和沉默片段，将酶切完全的γ载体和沉默片段进行连接；用MluⅠ 限制性内切酶酶切α、γ-GFP和γ-AAC载体，SpeⅠ 酶切β载体，线性化酶切产物并回收纯化。限制性内切酶NheⅠ、MluⅠ、SpeⅠ以及PCR产物纯化试剂盒均购自TaKaRa公司。Large Scale RNA Production Syetems-T7(Promega，美国)和Ribo m7U Cap Analog(Promega，美国)对线性化产物进行体外转录。

1.2.4TaAAC基因功能验证

在小麦抽穗期，选择长势良好、且大小一致的麦穗进行标记接种。将α、β、γ-GFP和γ-AAC体外转录产物各取2.5 μL，按1∶1∶1比例混合，用等体积的DEPC水混合，加入270 μL的FES缓冲液，混匀后置于冰上保存。接种时佩戴无酶橡胶手套，用无酶枪头吸取10 μL混合液点在食指上，左手固定麦穗，右手大拇指和食指轻轻来回摩擦麦穗，分别接种100穗。接种后喷洒少许DEPC水，封口膜覆盖保湿24 h。在接种后定期观察穗部变化并取样。

根据TaAAC基因cDNA序列设计qRT-PCR引物qRTAAC-F:5′-GGGTGGAGGTGACAGGCAAT-3′和qRTAAC-R:5′-AAGAGCAAAGCTGGCAAAGAA-3′。qTaActin-F:5′-CCTCTCTTAGCACTTTCCAGCA-3′和qTaActin-R:5′-GTAAGTCCCCTTCACCGACTC-3′。分别在接种后14、19、24和29 d进行取样，-80 ℃保存。在QuantStudio 5 Real-Time PCR System(Themo Fisher,BIO INC,CA,USA)上进行qRT-PCR分析，反应体系与程序参考TB Green TM Premix Ex Taq TM Ⅱ(TaKaRa，大连)试剂盒说明书，试验设置3个生物学重复和3个技术重复，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。qRT-PCR反应体系为：TB Green premix EX Taq Ⅱ(2 x)10μL，Forward Primer(10 μM)1 μL，Reverse Primer(10 μM)1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。qRT-PCR反应程序为：预变性95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，40个循环； 溶解曲线分析：95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.2.5 淀粉含量测定

采用Kang等[10]的方法测定总淀粉含量，参考何照范等[21]的方法测定直链淀粉含量，总淀粉减去直链淀粉得出支链淀粉含量。每个样品测定3次，求平均作为样本均值。

2 结果与分析

2.1 TaAAC基因序列特征

以百农207 cDNA为模板，克隆该基因的CDS序列，电泳检测结果如图所示(图1)，将PCR产物进行胶回收，连接至ZT4-Blunt载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，对应菌液测序，测序结果显示TaAAC基因，大小为1 143 bp，与来源于中国春的ACC基因序列进行比对，两者之间的DNA序列完全一致(图2)。

M:Marker 2000; 1:以百农207 cDNA为模板扩增TaAAC基因CDS序列。

2.2 TaAAC基因生物信息学分析

TaAAC基因CDS区域长度为1 143 bp，编码380个氨基酸。利用Pfam分析表明，TaAAC蛋白存在三个线粒体载体结构域(图2划虚线部分)。利用ProtComp 9.0预测结果表明，小麦TaAAC 蛋白可能定位于线粒体、内质网和质膜三个部位，得分分别为5.85、2.56和1.34。利用ExPASy-ProtParam分析表明，氨基酸不稳定指数为28.30，小于40，为稳定蛋白质。平均亲水性系数为负值，为亲水蛋白质。利用SOPMA进行二级结构预测，发现TaAAC蛋白二级结构主要由α-螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲4种成分组成。α-螺旋(43.95%)和无规则卷曲(37.89%)为主要成分，延伸链(12.63%)和β转角(5.53%)所占比例相对较少。利用SWISS-MODEL进行三级结构预测(图略)，结果与二级结构相一致，α-螺旋和无规则卷曲仍是主要的结构原件。

实线下划线表示沉默片段，虚线下划线表示TaAAC蛋白的线粒体载体结构域对应片段。

2.3 TaAAC基因编码蛋白的系统发育分析

利用MEGA 5.05对TaAAC蛋白进行系统发育分析(图3)，发现ATP/ADP转运蛋白可以分为两类，一类是位于质体膜蛋白，另一类是位于线粒体膜蛋白。从图3可以看出，本研究中TaAAC蛋白与线粒体膜蛋白亲缘关系较近，与质体膜蛋白亲缘关系较远。经BLAST分析发现，TaAAC蛋白与水稻(Oryzasativa，XP 015625645.1)的一致性为92.17%，与高粱(Sorghumbicolor)的一致性为89.46%，与粟(Setariaitalica)的一致性为88.95%。

不同物种的蛋白质ID号和括号中的蛋白定位信息均来自NCBI上的注释信息，进化树中分枝前的数字代表亲缘关系，分数越大，亲缘关系越近。

2.4 TaAAC基因的功能

本研究采用引物AAC-F和AAC-R，扩增出TaAAC基因CDS中长度为233 bp(图4A)的沉默序列片段(具体序列见图2中划实线部分)，将此沉默目的片段和γ载体利用NheⅠ限制性内切酶进行酶切并连接，成功构建BSMV-VIGS-TaAAC沉默载体。对α、β、γ-GFP和γ-AAC载体，酶切后线性化产物，并回收纯化(图4 B)。

M1:Marker 2000; 1:扩增片段。M2:Marker 10000; 2～5:α、β、γ-GFP和γ-TaAAC。

小麦抽穗期，选取长势良好且大小一致的百农207麦穗，分别在穗部摩擦接种BSMV-VIGS-TaAAC和 BSMV-VIGS-GFP，各接种100穗。在接种后15 d，接种BSMV-VIGS-TaAAC的麦穗表现出大麦条纹花叶病毒黄斑症状，接种后 25 d黄斑症状蔓延至整穗(图5)。分别在接种后 14 d、19 d、24 d和29 d取样，采用qRT-PCR方法，检测了TaAAC在籽粒中的转录水平(表1)。结果表明，与接种BSMV-VIGS-GFP的对照植株籽粒相比，接种BSMV-VIGS-TaAAC的籽粒中TaAAC的表达量显著下降，在接种后第 24 d和第29 dTaAAC基因表达量分别下降了51%和67%，表明成功获得了TaAAC基因沉默的小麦植株。

表1 接种BSMV-VIGS-GFP和BSMV-VIGS-TaAAC后不同时期小麦籽粒中TaAAC的转录水平

A:BSMV-VIGS-TaAAC; B:BSMV-VIGS-GFP.

成熟期分别收获接种BSMV-VIGS-TaAAC和BSMV-VIGS-GFP的籽粒(图6)，测定千粒重、总淀粉含量、直链淀粉含量和支链淀粉含量(表2)。与接种BSMV-VIGS-GFP的对照植株相比，接种BSMV-VIGS-TaAAC的籽粒中直链淀粉含量下降了7.78%，支链淀粉含量下降了24.61%，千粒重下降了12.44%，总淀粉含量下降了 19.87%。统计分析结果表明，千粒重和总淀粉含量与对照的差异均达到显著水平。这些结果表明TaAAC基因可能参与了调控小麦籽粒淀粉的合成，进而影响了粒重。

A:BSMV-VIGS-GFP; B:BSMV-VIGS-TaAAC.

表2 诱导TaAAC基因沉默植株及对照的千粒重、总淀粉含量、直链淀粉含量和支链淀粉含量的差异

3 讨 论

ATP为生物体内许多的生理生化反应提供大量的能量，维持整个机体正常运转。线粒体为植物生长代谢提供了主要的能量来源,位于线粒体内膜的ATP/ADP转运蛋白，运输线粒体内ATP与细胞质中的ADP正常交换，连接ATP的生成和输出[22]。除了线粒体中的ATP/ADP转运系统，在质体上也存在着同样的转运机制[23]。通过质体ATP/ADP转运蛋白将细胞质的ATP转运到质体腔内,为质体内淀粉和脂肪酸的合成提供能量[24]。本研究通过对TaAAC蛋白的亚细胞定位预测发现，该蛋白可能定位于线粒体膜和质体膜上；系统进化树分析结果表明，ATP/ADP转运蛋白包括质体膜蛋白和线粒体膜蛋白，与TaAAC蛋白质亚细胞定位结果相符合，但与线粒体膜蛋白的亲缘关系更近。关于TaAAC蛋白的亚细胞定位还有待于进一步通过构建表达载体来确定。

BSMV-VIGS是进行基因功能验证的一个方便和有效的技术手段，Bennypaul等[25]利用BSMV-VIGS技术沉默GBSS基因，导致小麦籽粒中直链淀粉的含量下降了30%～40%；吕亮杰等[26]应用BSMV-VIGS技术沉默负向调控小麦淀粉的合成的WSR1基因，导致籽粒内支链淀粉和总淀粉含量显著增加。因此，采用BSMV-VIGS技术研究TaAAC功能完全可行。同时，本课题组经过多年的田间试验，在接种期间，在接种区域植株上方搭建临时控温棚，以保持该区域的温度和湿度，增加接种效率。由于小麦是异源六倍体，TaAAC在6A、6B和6D上的同源性高达99.29%。因此，本研究中沉默的TaAAC的表达量的可能来自于3个拷贝。关于不同染色体上TaAAC表达量的高低，以及对淀粉合成的作用有待进一步通过基因编辑获得不同突变体植株进行研究。

研究表明，质体ATP/ADP转运蛋白对淀粉合成和粒重高低有显著调控作用[14,19]。同时ATP/ADP转运蛋白可以介导细胞质中的ATP为AGPase 合成ADP-葡萄糖(ADPG)提供能量[23]，调控这一个限速步骤中的能量来源，可以改变淀粉的合成速率和结构。本研究利用BSMV-VIGS技术，在成功沉默TaAAC基因的植株中籽粒淀粉含量和千粒重显著下降，表明TaAAC基因影响了ATP/ADP的转运,从而影响了小麦籽粒淀粉合成的过程。由于AGPase存在胞质型和质体型两种形式，且两种存在形式的基因表达量高低均对淀粉合成和籽粒粒重有显著影响[10,12]，本研究中TaAAC可能存在于线粒体和质体，关于TaAAC调控淀粉合成的机制有待进一步的探究。