FADD形成淀粉样蛋白纤维及其在果蝇免疫信号传递中的作用

王鑫怡，肖晓艺，孙畅，王菲

西南大学 生物学研究中心，重庆 400716

无脊椎动物和脊椎动物在长期进化过程中形成了非常保守的先天免疫系统[1]。两者在先天免疫信号途径中存在诸多同源分子，它们具有相似的结构特征、作用特点和调控方式。而果蝇作为昆虫先天免疫研究的模式生物，阐明其先天免疫信号通路中关键蛋白的分子作用机理，有助于更清楚地了解昆虫先天免疫信号通路中的调节机制，对研究其他物种的免疫调控具有重要参考意义。

病原微生物入侵时，昆虫体内的多层防御机制被激活，主要包括细胞免疫和体液免疫[2]。细胞免疫由血淋巴细胞介导，依赖吞噬和包裹清除入侵的病原体[3]。体液免疫主要涉及抗菌肽 AMPs(Antimicrobial peptide) 和黑化因子的产生，昆虫脂肪体产生并分泌AMPs到血淋巴中，裂解杀死细菌；黑化因子沉积在入侵者的周围，形成黑色素囊包裹入侵者并将其杀死[4]。果蝇体液先天免疫应答主要受两条NF-κB信号通路——Toll和IMD信号通路调控[5]。Toll通路主要抵御革兰氏阳性菌和真菌，产生Drosomycin等抗菌肽[6]；而IMD通路主要感知大多数革兰氏阴性菌及少数具有内消旋-二氨基庚二酸型肽聚糖 DAP-type PGN (Diaminopimelic acid-type peptidoglycan) 的革兰氏阳性菌的感染，产生Attacin、Diptericin等抗菌肽。在IMD信号通路中，跨膜受体 PGRP-LC或膜内受体 PGRP-LE识别 DAP-型 PGN，招募膜内衔接蛋白 IMD(Immune deficiency)，IMD进一步招募配体蛋白FADD (Fas-associated death domain-containing protein) 与Dredd (Death-related ced-3/Nedd2-like protein)，促使Dredd活化，活化的Dredd特异性切割IMD和NF-κB家族转录因子Relish，切割后的IMD结合E3泛素化连接酶DIAP2发生泛素化[7-8]，招募TAK1和IKK[9]，磷酸化切割后的Relish，Relish具有转录活性的N端进入细胞核，激活AMPs的表达[10-11]。

果蝇FADD (dFADD) 是哺乳动物FADD的同源物，其N端具有一个DED结构域 (Death-effector domain)，C端包含一个DD结构域 (Death domain)。在IMD信号通路中，dFADD分别通过其DD结构域和 DED结构域与上游同样包含 DD结构域的IMD和下游同样包含DED结构域的Dredd相互作用，调控抗菌级联信号的传递[12-14]。然而，目前关于dFADD的研究仅限于功能，其潜在的作用机制仍不清楚。研究报道，在IMD信号通路中，果蝇PGRP-LC、PGRP-LE和IMD能够形成功能性淀粉样蛋白纤维聚合物，且该淀粉样蛋白纤维是 IMD信号传递所必需的[15]。最近，本研究团队发现家蚕Dredd也能形成功能性蛋白聚合物[16]。

为进一步深入研究dFADD在IMD信号通路中的作用机制，本研究拟通过ThT染料结合、透射电镜观察等鉴定原核表达纯化的 dFADD蛋白在体外能否形成淀粉样蛋白纤维；通过共聚焦显微镜观察、ThT染色以及 SDD-AGE检测等方法在细胞水平上鉴定 dFADD是否在细胞内形成淀粉样蛋白纤维聚合物；通过构建结构域突变体，鉴定纤维形成的关键结构域以及在IMD信号传递中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

果蝇S2细胞系衍生自胚胎，由本实验室保存,在27 ℃条件下，培养在添加10%胎牛血清 (非热灭活) 和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的Schneider’sdrosophilamedium (Gibco) 中。

Tubulin抗体、HRP标记山羊抗鼠抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、NP-40裂解液、DAPI染色液、蛋白酶抑制剂PMSF等购自上海碧云天生物技术有限公司；HA标签单克隆抗体购自Invitrogen；彩色预染蛋白质分子量标准购自 Thermo Scientific；DAP-型PGN购自Sigma；细胞转染试剂购自 Roche；BL21 (DE3) pLysS感受态细胞、Trans-T1噬菌体抗性化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；超纯质粒试剂盒购自Qiagen；点突变试剂盒购自TaKaRa；pCold-Sumo载体购自 Hai gene；ThT试剂购自 Santa Cruz；Dual-Glo双荧光素酶活检测试剂购自Promega。

1.2 质粒构建

原核表达质粒 pCold-Sumo-dFADD及真核表达质粒pMT/V5-HisA-HA-dFADD、pMT/V5-HisAHA-dFADD-mCherry的构建均根据 NCBI检索到的各个基因的CDS序列设计引物并扩增出正确片段克隆至相应载体上，dFADD结构域突变体的构建根据点突变试剂盒使用说明，以上序列均送深圳华大基因股份有限公司测序。本研究所用引物如表1所示，所构建载体图谱如图1所示。

1.3 细胞转染

将细胞进行血球计数板计数后接种至12孔细胞板 (1×105个细胞/孔)，待细胞生长至对数生长期，0.5 μg/孔的质粒与1 μL/孔的脂质体混合孵育15 min，转染至细胞中，5 h后进行CuSO4诱导 (终浓度为 500 μmol/L)，24 h后收集细胞用于SDD-AGE检测或制备细胞爬片。以上转染均使用分光光度计对转染的质粒进行定量。

1.4 细胞爬片的制备及ThT染色

将细胞旧培养基吸净弃之，添加500 μL 3%多聚甲醛 (PFA) 固定细胞20 min，PBS轻轻地冲洗一次，添加 500 μL 0.3% Triton-X100，静置 20 min，添加3 mmol/L ThT摇晃染色20 min (避光操作)，70%乙醇清洗3次/min，PBS清洗3次，每次3 min，添加500 μL DAPI染色液，静置5 min，PBS清洗3次，每次3 min，向载玻片上滴加3 μL抗荧光淬灭封片液，夹起细胞爬片置于封片液上，于4 ℃避光保存。dFADD点状分布和弥散分布细胞数量的统计执行3个孔的重复。每个重复随机选取5个视野，计数 (200±5) 个细胞。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

图1 dFADD的原核和真核表达载体图谱Fig. 1 Prokaryotic and eukaryotic expression vector maps of dFADD. Black line: restriction enzyme cutting site; black box: dFADD ORF; dark grey box: sequence encoding His-Sumo; white box: sequence encoding HA tag;light grey box: sequence encoding mCherry.

1.5 原核表达纯化蛋白及ThT结合实验、透射电子显微镜观察

将表达pCold-Sumo-dFADD质粒的菌液于1 L LB氨苄液体培养基中扩大培养至OD值为0.4–0.6，添加 0.1 mmol/L 的 IPTG，15 ℃、220 r/min诱导蛋白表达24 h。6 000 r/min、4 ℃离心20 min收菌，用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、300 mmol/L NaCl、1 mmol/L β巯基乙醇，5%甘油，1 mmol/L PMSF的缓冲液重悬菌沉淀，超声破碎7 min 30 s，4 ℃、16 000 r/min离心45 min，收集蛋白上清，挂镍柱，再用不同浓度梯度的咪唑将其洗脱，SDS-PAGE鉴定蛋白大小及纯度。对目标蛋白浓度最高的洗脱液脱盐处理，Sumo酶酶切30 ℃、1 h，反挂镍柱，收集流穿液，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，BCA测定蛋白浓度。

ThT结合实验：用10 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4) 将纯化的 dFADD稀释至反应终浓度为32 μmol/L，ThT反应终浓度为 25 μmol/L，再将dFADD进行不同程度的梯度稀释，阳性对照为Aβ蛋白，阴性对照为BSA蛋白，分别将各蛋白样品于37 ℃、1 000 r/min孵育24 h，孵育体积不少于400 μL。随后将蛋白样品转移至96孔黑色酶标板，添加新鲜配制的ThT溶液，摇晃孵育15 min，上机检测：固定激发光为440 nm，检测470–600 nm不同发射光的荧光强度。

透射电子显微镜观察：吸取终浓度为37 μmol/L的蛋白样品滴加于铜网格上，吸附1 min，风干，用2%乙酸铀酰水溶液负染45 s，去除多余染液，风干，透射电镜观察，电压200 kV。

1.6 SDD-AGE

凝胶制备：1×TBE配制含0.1% SDS的1.5%琼脂糖凝胶。样品制备：将细胞裂解物 (细胞裂解液：NP-40裂解液+1 mmol/L DTT+2 mmol/L PMSF)与蛋白上样缓冲液 (配制4×母液：2×TBE，20%甘油，8% SDS，0.2%溴酚蓝，室温保存，使用终浓度为1×) 混合，37 ℃孵育5 min，蛋白上样总量为80 μg。电泳：水平凝胶电泳 (电泳缓冲液：1×TBE+0.1% SDS)，恒压3 V/cm (凝胶宽度)，于4 ℃冰箱中进行。毛细管转膜：由下往上依次放置：5 cm干滤纸、一层转膜缓冲液 (1×TBS) 浸湿滤纸、PVDF膜、凝胶、一层浸湿滤纸、一层浸湿滤纸桥。室温静置 9 h。转膜完成后，执行标准的 Western blotting检测。

1.7 双荧光素酶检测

将旧培养基吸净弃之，添加300 μL PBS重悬细胞于 1.5 mL离心管，10 000 r/min、4 ℃离心5 min。吸取120 μL Dual-Glo双荧光素酶活检测试剂重悬细胞，室温摇晃裂解 15 min，吸取 50 μL至96孔黑色酶标板，用GloMax-Multi微孔酶标仪读数。取出酶标板，吸取50 μL终止反应检测试剂加入对应孔中，摇晃混匀 10 min，使用酶标仪读数。本实验采用海肾荧光素酶质粒作为内参。每个样品取 3个孔的重复，数据用±s表示，并通过ANOVA单因素方差分析后采用邓肯氏 (Duncan)新复极差测验法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 dFADD在体外形成淀粉样蛋白纤维聚合物

采用带有His-Sumo标签的pCold-Sumo载体原核表达纯化His-Sumo-dFADD，该蛋白在200 mmol/L咪唑浓度下被大量洗脱 (图 2A)，随后使用 Sumo酶切除His-Sumo标签，得到大小为27 kDa的蛋白dFADD (图 2B)。分别使用灰度计算软件Image J及BCA蛋白浓度测定法对该蛋白的纯度和浓度进行分析，结果表明，dFADD纯度和浓度分别约为96.2%和 37 μmol/L，可进行后续实验。硫黄素 T(ThT) 是一种淀粉样蛋白纤维聚集体的特异性荧光染料。ThT与淀粉样蛋白纤维结合后，光谱性质发生变化，激发波长从335 nm增加至445 nm，发射波长由400 nm增加至485 nm。ThT结合实验表明，dFADD能够与ThT染料特异性结合，改变ThT的光谱性能，使其在440 nm的激发光下，在发射波490 nm处产生与阳性对照——典型的β淀粉样蛋白Aβ一样的峰值 (图2C)，且呈现出剂量依赖效应。纯化的dFADD蛋白在透射电子显微镜下呈现明显的聚集现象 (图2D)，dFADD发生明显聚集，但大多数为无定形聚集 (如白色箭头所示)，只有少数部分能够聚合形成较大的聚集体 (如黄色箭头所示)，且该聚集体整体呈现为纤维状。综上所述，dFADD在体外可聚集形成淀粉样蛋白纤维聚合物。

图2 dFADD的原核表达纯化、ThT结合及透射电子显微镜观察Fig. 2 Prokaryotic expression and purification, ThT binding and transmission electron microscopy of dFADD. (A) Imidazole concentration gradient elution of dFADD. 1: supernatant; 2: sedimentation; 3: flow through; 4: 0 mmol/L; 5: 10 mmol/L; 6:20 mmol/L; 7: 50 mmol/L; 8: 100 mmol/L; 9: 200 mmol/L; 10: 300 mmol/L; 11: 500 mmol/L; 12: 800 mmol/L; 13: 1 mol/L;M: protein pre-stained marker (kDa); black arrowhead: His-Sumo-dFADD. (B) The imidazole concentration gradient elution of dFADD after digested by Sumo enzyme. 1: uncut; 2: after digestion; 3: flow through; 4: 0 mmol/L; 5: 10 mmol/L; 6:20 mmol/L; 7: 50 mmol/L; 8: 100 mmol/L; 9: 200 mmol/L; 10: 500 mmol/L; M: protein pre-stained marker (kDa); black arrowhead: His-Sumo-dFADD; brown arrowhead: dFADD; blue arrowhead: Sumo enzyme; gray arrowhead: His-Sumo. (C)ThT binding assay of dFADD. (D) Transmission electron microscopy of dFADD. White arrowhead: amorphous aggregation of dFADD; Yellow arrowhead: amyloid fiber aggregates of dFADD.

2.2 dFADD在细胞内形成淀粉样蛋白纤维聚合物

为探究dFADD在体内是否形成淀粉样蛋白纤维聚合物，模拟在体外培养果蝇S2细胞中过表达dFADD-mCherry融合蛋白，通过共聚焦显微镜观察 dFADD的细胞定位及分布情况，发现 dFADD在果蝇 S2细胞中呈现两种分布：一种呈点状(图3A)，此种形式数量较少，但其荧光强度较亮；另一种则弥散分布于整个细胞质中，荧光强度较弱一些 (图3B)。在果蝇IMD信号通路中一些能够形成淀粉样蛋白纤维聚合物的蛋白，如 PGRP-LC等也呈现这样的点状聚集形式[15]，因此推测这种点状分布的dFADD可能也是蛋白聚合体。为排除蛋白聚集是由于过量表达所造成的，同时转染了等量的mCherry蛋白表达载体 (图3C)，该蛋白均匀分布于细胞中，证实过量表达不会造成蛋白的聚集。

图3 dFADD的荧光观察、ThT染色及SDD-AGE检测Fig. 3 Fluorescence observation, ThT staining and SDD-AGE detection of dFADD. (A) Puncta-like distribution of dFADD-mCherry. (B) Diffuse distribution of dFADD-mCherry. (C) Diffuse distribution of mCherry. (D) Puncta-like distribution of dFADD-mCherry specifically binds to ThT. (E) Diffuse distribution of dFADD-mCherry does not specifically bind to ThT. (F) SDD-AGE detection of HA-dFADD.

对过表达dFADD-mCherry蛋白的S2细胞进行 ThT染色，经荧光显微镜观察发现点状分布的dFADD与ThT绿色荧光重叠，表明其能够与ThT特异性结合，这些点状物即为淀粉样蛋白纤维聚合物 (图3D)。相反，弥散分布的dFADD则未呈现出ThT绿色荧光 (图3E)，表明其未发生聚合。这些结果表明 dFADD在细胞内部分形成淀粉样蛋白纤维聚合物，这与电镜观察的结果一致。SDD-AGE是一种半变性琼脂糖凝胶电泳技术，该技术SDS用量少，基本不破坏聚集体，并借助疏松网状的琼脂糖凝胶进行大分子蛋白的迁移。本研究通过SDD-AGE检测过表达HA-dFADD的S2细胞裂解物，发现HA-dFADD在细胞内以单体与聚合物共存 (图3F)。

2.3 DED结构域是dFADD纤维形成的关键结构域

为探究dFADD淀粉样蛋白纤维的形成与哪一个结构域有关，构建了删除dFADD结构域的真核表达载体 (图4A)，SDS-PAGE检测各突变体蛋白成功表达 (图 4B)。随后对 dFADD-WT及其突变体进行 SDD-AGE检测，结果显示，dFADD-WT存在聚合物和单体两种形式，且单体量较高；dFADD-ΔDED 仅以单体形式存在；dFADD-ΔDD则表现出单体明显减少、聚合物明显增多的特征(图4C)。荧光观察结果显示，dFADD-ΔDD在细胞内具有聚集和弥散两种分布，其聚集形式能够被ThT染色，呈现绿色荧光；而dFADD-ΔDED仅有弥散分布一种形式，不能与ThT结合 (图4D、E)。同时对dFADD及其突变体的聚集形式和弥散形式的比例进行了统计 (图4F)，dFADD-WT的聚集比例为 19.23%，dFADD-ΔDED 的聚集比例为 0，dFADD-ΔDD的聚集比例为 31.77%。此外，PGN刺激后，dFADD-WT和dFADD-ΔDD的聚集比例均有所上升，分别为24.10%和38.22%。以上结果均表明，DED结构域是dFADD纤维形成的关键结构域，且PGN刺激能够诱导更多dFADD聚集。

2.4 dFADD纤维形成是IMD信号传递的关键

为进一步探究dFADD形成的淀粉样蛋白纤维在IMD信号通路中的作用，在细胞中表达dFADD或其突变体，利用双荧光素酶报告系统对抗菌肽Attacin和 Diptericin的诱导水平进行了检测。结果显示，在 PGN刺激下，dFADD-ΔDED对抗菌肽的表达无促进作用，或远低于 dFADD-WT和dFADD-ΔDD；而蛋白聚合比例较高的dFADD-ΔDD，促进抗菌肽表达的作用则高于dFADD-WT (图 5A、B)。以上结果表明，dFADD淀粉样蛋白纤维的形成是IMD信号通路传递的关键，是诱导抗菌肽产生所必需的。

3 讨论

淀粉样蛋白聚集体最早被发现与人类淀粉样蛋白疾病有关。某些蛋白或多肽错误折叠并形成淀粉样蛋白纤维，在器官和组织的胞外空间中沉积，从而导致疾病发生，例如Aβ蛋白导致的阿尔茨海默氏症，阮病毒蛋白导致的海绵状脑病，α核蛋白导致的帕金森病等[17]。然而，近年来从细菌到昆虫再到人类，逐渐发现一些功能性淀粉样蛋白纤维，它们并不导致疾病发生，而是在体内发挥正常的生理功能，例如PMEL形成淀粉样纤维作为支架沉积和储存哺乳动物黑色素；荧光假单胞菌的FapC组成的原纤维有助于生物膜的形成和稳定；生殖特异性胱抑素蛋白Cst8在体外形成淀粉样蛋白原纤维，在精子成熟或维持管腔环境中发挥作用[18-20]。对哺乳动物信号传导的研究发现，RIPK1和RIPK3的RIP同型相互作用基序RHIMs介导了其异二聚体丝状结构的组装，二者形成淀粉样蛋白纤维复合物，在诱导细胞程序性坏死的信号通路中是不可或缺的[21-23]。与此相似的是，在昆虫的IMD免疫信号通路中，PGRP-LC、PGRP-LE、IMD三种蛋白形成功能性淀粉样蛋白纤维聚合物，PGRP-LC或PGRP-LE首先聚合形成淀粉样蛋白原纤维，成为下游IMD纤维聚合的核心，促进IMD的聚合，纤维形成是IMD通路的信号传递所必需的[15]。这暗示着对于哺乳动物和昆虫，信号分子的组织形式和信号传递方式具有进化上的保守性。dFADD纤维参与IMD级联调控的分子作用尚需要后续深入研究。

图4 dFADD-WT及其突变体真核表达载体的构建、SDD-AGE检测及荧光观察Fig. 4 Eukaryotic expression vector construction, SDD-AGE detection and fluorescence observation of domain-deleted mutants of dFADD. (A) Schematic diagram of dFADD-WT and its domain-deleted mutants. (B)SDS-PAGE detection of dFADD-WT and its mutants. M: protein pre-stained marker (kDa). (C) SDD-AGE detection of dFADD-WT and its mutants. (D) Fluorescence observation of dFADD’s mutants. (E) Fluorescence observation of dFADD’s mutants after ThT staining. (F) The ratio of puncta-like vs. diffuse distribution of dFADD and its mutants in the absence or presence of PGN.

图5 dFADD-WT及其突变体对抗菌肽表达的影响Fig. 5 Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of antimicrobial peptides. (A) Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of the antibacterial peptide Attacin. (B) Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of the antibacterial peptide Diptericin. PGN: DAP-type PGN (10 μg/mL). a–f: differences are assigned by letters, overlapping letters mean no significance.

本研究发现dFADD也能够自组装聚合成类似的功能性淀粉样蛋白纤维，其能够与淀粉样蛋白纤维特异性染料结合，在透射电子显微镜下呈现明显的高分子聚合特征，形似纤维。然而，该分子在体外或在模拟体外培养果蝇S2细胞中的聚合能力是较弱的，少数形成纤维，大部分仍是以无定形的较小聚合物形式存在，或者不发生聚合以单体形式存在。在PGN刺激下，dFADD形成聚集体的能力有所增强，说明其聚集响应免疫诱导。而dFADD-ΔDED突变体不能形成淀粉样蛋白纤维聚合物并且无法诱导抗菌肽Attacin和Diptericin的表达，进一步说明了淀粉样蛋白纤维在免疫信号通路中的作用。这些结果提示dFADD纤维分子可能作为原纤维核心在IMD信号通路中协同参与了上游IMD的淀粉样蛋白纤维的形成，改变IMD纤维特征，促进与下游分子Dredd等分子的相互作用，调控抗菌级联信号的传递。

有意思的是，dFADD-ΔDD 突变体对抗菌肽Attacin和Diptericin表达的促进能力明显增强，可能暗示dFADD的DD结构域对dFADD淀粉样蛋白纤维的形成有一定程度的干扰。类似现象也存在于哺乳动物 FADD介导的细胞凋亡信号通路中，FADD的DED结构域能够形成死亡效应纤丝，该纤丝的形成是细胞凋亡信号传递所必需的。当只表达 DED结构域时，细胞凋亡率要高于同时包含DED结构域和 DD结构域的全长型FADD[24-27]，说明在无DD结构域存在的情况下，DED结构域的功能可能有所增强。统计dFADD-mCherry及其突变体在细胞中呈现聚合形式的比例，发现dFADD-ΔDD 呈现聚合的比例高于 dFADD-mCherry-WT，这也与二者促进抗菌肽产生的能力相对应，当dFADD聚合物增多时，其促进抗菌肽产生的能力进一步增强。

dFADD 通过其 DED 结构域与 Dredd(Caspase8同源物) 相互结合，促进下游抗菌肽的产生或诱导细胞凋亡。Dredd的 N端也包含两个DED结构域[28]。笔者研究团队在研究家蚕 Dredd时，发现BmDredd能够聚合形成淀粉样蛋白纤维，且BmDredd与BmFADD的细胞共定位表明，二者能够共同聚合形成淀粉样蛋白纤维聚合物[16]，这提示了果蝇 Dredd也可能形成淀粉样蛋白纤维聚合物。由此 IMD信号通路中，已鉴定或预测到PGRP-LC、PGRP-LE、IMD、dFADD与Dredd均能够形成淀粉样蛋白纤维聚合物，暗示它们能够组装形成类似于在哺乳动物细胞中鉴定到的超分子复合物，对迅速高效的免疫信号传递和抗菌肽的诱导至关重要，值得深入研究。