氢分子对肝癌细胞Huh7的影响

商蕾, 李佳腊, 苏泽华, 谢飞, 马雪梅

北京工业大学生命科学与生物工程学院， 北京 100124

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，据2018年的世界卫生组织发布的世界癌症报告称，目前肝癌的患病人数在全球男性中排名第五，女性中排名第九，死亡人数全球排名分别为第二和第六[1]。常见的致病因素有：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、肝硬化、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、肝炎病毒感染、黄曲霉素污染的食物等[2-8]，其中大约75%的肝癌病例是由乙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒导致的肝硬化引发的[9]。在肝、肺、结肠和胃等4种恶性肿瘤中[10]，我国每年约有13万患者死于肝癌，占全世界肝癌病死总人数的45%，且每年新发46万人，占全世界的55%，属于肝癌多发和高发国家[11]。这跟我国是肝炎高发病率的国家密切相关[9]。国际肝癌疾病研究协会数据显示，肝癌的病死高发人群逐渐向青壮年偏移[12-13]。且因肝癌具有多复发、转移性强和耐药等特点，使得临床治疗中多种治疗方式对于肝癌的治疗效果均不理想，且肝癌患者的预后及恢复效果也极差[14]。因此，减少肝癌的转移和复发是目前的研究重点。

作为自然界最简单的分子，氢分子长期以来被人们认为是一种生理惰性气体，而近十几年来，氢分子医学领域发展十分迅速，并在各种疾病中展现出多种生物学效应，包括缓解创伤炎症、控制代谢疾病、缓解有机磷农药引起的神经毒性以及抑制肿瘤生成等[15]。氢分子发挥生物学作用的机理尚无定论，其可能通过选择性清除毒性自由基来抑制氧化应激反应，也可能通过作用于生物酶或调节细胞内信号分子来发挥作用[16-20]。Li等[21]研究肾细胞癌时发现，氢分子可防治次氮基三乙酸铁诱导的肾脏毒性和致癌性。研究显示，饮用富氢水可以显著降低组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)和过氧化亚硝酸盐的含量，从而降低氧化应激水平、缓解炎症反应，进而减弱次氮基三乙酸铁诱导的大鼠肾毒性，减轻大鼠的肾脏损伤并抑制其肿瘤早期发展，证明富氢水能够通过抗氧化和抗炎症作用达到对次氮基三乙酸铁诱导的肾毒性和致癌性的防治效果[21]。此外，氢分子还能减轻恶性肿瘤治疗所引发的副作用。如Kang等[22]的研究表明，通过让放疗期间的肝癌患者饮用6周富氢水，可以显著降低肝癌患者血液中活性氧代谢产物并维持了血液中的氧化电势，提高患者的生活质量，提示氢分子能通过减少辐射诱导的氧化应激反应，来减少放射治疗的副作用。

目前，氢气的介入方法主要集中在以下方面：呼吸氢气、富氢水饮用、富氢生理盐水注射、氢气浴、氢气滴眼液以及肠道氢气介入等等，分别应用于不同疾病的治疗或动物/细胞模型的研究[23]。本研究采用含氢培养基对人肝癌细胞Huh7进行处理，使用CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况，悬浮培养克隆球和平板克隆实验检测细胞成球能力和细胞干性，细胞划痕实验和Transwell小室实验分别检测细胞迁移和侵袭的能力，细胞免疫荧光实验检测波形蛋白的表达情况，从而研究氢分子对肝癌细胞Huh7的影响，以期增加肝癌病人的生存率、提高患者的生活质量，并为氢分子对肝癌疾病的预防和治疗提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1 实验材料

人肝癌细胞Huh7细胞株由北京大学第三医院惠赠。CCK-8购于东仁化学科技(上海)有限公司；富氢水发生器购于上海潓美医疗科技有限公司；RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基、青链霉素(100×)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、B27无血清添加剂、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、0.25% Trypsin-EDTA购于美国Gibco公司；细胞周期检测试剂盒和凋亡检测试剂盒购于美国Millipore公司；Matrigel基质胶购于美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1含氢培养基的制备 将氢气发生器接出的硅胶管放入含培养基的50 mL离心管中，在离心管的盖子上剪出1个比硅胶管稍大一些的小孔，保证能让小管插入至底部，并且在硅胶管中间接入1个0.22 μm的过滤器使气体进入培养基时过滤掉细菌等；打开制氢机开始产生氢气，会看到培养基里的硅胶管有气泡冒出，持续通入氢气约1 h，保持氢气达到饱和后进行下一步使用。

1.2.2细胞培养 细胞培养的过程一般有细胞复苏、培养、传代和冻存4个部分，具体实验方法参照商蕾等[24]的研究。实验分为2组：含氢培养基组(H)和对照组(C,即不通氢气的培养基)。

1.2.3细胞计数方法 采用常用的台盼蓝染料浸染细胞方法进行细胞计数，通过活细胞的细胞膜具有选择通透性这一特点来区分。具体实验方法参照商蕾等[24]的研究。

1.2.4细胞活性测定(CCK-8法) CCK-8法是较为常用的用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细胞数目的一种方法，具有高灵敏度，无放射性的特点。本研究利用该方法检测在450 nm处的吸收峰来判断细胞活性情况，以确定氢分子对Huh7细胞活性的影响。具体实验方法参照商蕾等[24]的研究。

1.2.5细胞周期检测 收集对数生长期的细胞并计数，调至细胞浓度1×105cells·mL-1，在六孔板中每孔接种20万细胞。置于培养箱中培养24 h，然后根据实验分组用移液器吸去孔板中的培养基，每孔替换普通培养基或含氢培养基，继续培养24 h。取出六孔板，收集细胞用70%冰乙醇固定，4 ℃静置过夜。第2天取出固定后的细胞，用PBS洗去固定液，加入200 μL细胞周期检测试剂，室温避光孵育20 min后，上机进行流式检测。

1.2.6细胞凋亡检测 收集对数生长期的细胞并计数，调至细胞浓度1×105cells·mL-1，在六孔板中每孔接种20万细胞。置于培养箱中培养24 h，然后根据实验分组用移液器吸去孔板中的培养基，每孔替换普通培养基或含氢培养基，继续培养24 h。取出六孔板，收集细胞，用1% FBS的PBS清洗2遍，离心后用1% FBS的PBS重悬，然后加入100 μL细胞凋亡检测试剂，室温避光孵育20 min后，上机进行流式检测。

1.2.7细胞克隆球形成实验 采用Huh7细胞进行细胞克隆球形成实验，具体实验方法参照商蕾等[24]的研究。通过克隆球的形成效率，来研究氢分子对Huh7细胞克隆球形成的影响。

1.2.8细胞平板克隆实验 采用Huh7细胞进行细胞平板克隆实验，具体实验方法参照商蕾等[24]的研究。通过观察细胞形成克隆的能力，来研究氢分子对Huh7细胞的成瘤率的影响。

1.2.9细胞划痕实验 采用Huh7细胞进行细胞划痕实验，具体实验方法参照商蕾等[24]的研究。通过观察细胞迁移的情况，来研究氢分子对Huh7细胞迁移能力的影响。

1.2.10细胞侵袭实验 采用Huh7细胞进行细胞侵袭实验，具体实验方法参照商蕾等[24]的研究。通过观察细胞侵袭的情况，来研究氢分子对Huh7细胞侵袭能力的影响。

1.2.11细胞免疫荧光 采用Huh7细胞进行细胞免疫荧光实验，具体实验方法参照商蕾等[24]的研究。通过观察波形蛋白的表达情况，来研究氢分子对Huh7细胞中波形蛋白表达的影响。

1.3 统计学分析

本研究采用统计软件GraphPad Prism 6.01版本分析所有数据资料。在符合正态性和方差齐性的前提下，以均数±标准差(M±S)进行统计学描述；统计推断则采用t检验(t-test)。

2 结果与分析

2.1 富氢培养基的制备

为了研究氢分子在体外对肝癌细胞系的作用，首先需要制备含有一定氢气浓度的细胞培养基。利用氢气发生器，将其产生的氢气通过硅胶管接入RPMI-1640培养基中，1 h后使用氢电极对培养基中的氢浓度进行检测，检测过程中培养基保持稳定不晃动，这可以使氢气不会因人为原因快速逸出。

如图1所示，含氢培养基组(H)的氢浓度与对照组(C)相比，C组的氢气浓度是远远低于H组的。在0 min左右时检测到含氢培养基的氢浓度最高为1.6 mg·L-1，由于氢气在水中的溶解度极低，因此C组中培养基的氢浓度保持不变，只有0.02 mg·L-1。同时图中显示，0～60 min内培养基中的氢浓度变化不大，表明氢浓度已经达到饱和，并且在相对较长的时间内保持较高的浓度。该结果表明使用氢气发生器可以制备含氢培养基，并在一定的时间内保持有效浓度。

图1 细胞培养基中氢浓度变化Fig.1 Hydrogen concentration in cell culture medium

2.2 氢分子对肝癌细胞活性的影响

按分组采用不同培养基处理Huh7细胞不同时间，用CCK-8法检测氢分子对Huh7细胞的活性的影响，通过在450 nm吸收峰处定时检测，可反映出Huh7细胞在不同处理条件下的增殖水平和生长状态。本研究监测了Huh7细胞在120 h内的生长情况，结果如下图2所示。与C组相比，氢分子处理Huh7细胞后，细胞在前24 h内的生长没有明显变化，24 h后H组细胞增殖速率明显低于C组，在72 h和120 h具有显著性差异(P<0.05)；在120 h内，细胞的总体增长速率小于C组，且细胞活性始终低于C组。结果表明，氢分子能够在一定程度上抑制Huh7细胞的生长，降低细胞的活性，且氢分子在抑制细胞活性的同时对细胞本身没有明显的毒性作用。

注：*—H组与C组间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。

2.3 氢分子对肝癌细胞系细胞周期的影响

细胞周期反映了细胞从上一次分裂结束至下一次分裂开始的过程，细胞周期异常是肿瘤细胞的重要特性之一。在正常细胞中，细胞周期受多种信号通路调控，细胞有序的生长、进行DNA复制及分裂等活动[25]。这一过程涉及的机制可确保细胞的正常生长，若机制出现错误，细胞的凋亡通路便会被激活，并调控细胞程序性死亡。在肿瘤中，由于基因突变等原因，细胞周期调控出现异常，最终导致肿瘤细胞增殖失控，细胞DNA大量复制，细胞不断分裂，增殖速度加快。已知CCK-8法检测结果表明氢分子能够抑制肝癌细胞的活性，因此，为了进一步探讨氢分子对肝癌细胞增殖水平的影响，本实验按分组采用不同培养基处理Huh7细胞24 h，通过流式细胞术来检测细胞周期情况，探讨氢分子对肿瘤细胞周期的影响。

如图3所示，细胞周期G0/G1期为DNA合成前期，在此期间主要合成DNA复制所需的RNA和核糖体；S期为DNA合成期，在此期间DNA大量复制；G2/M期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期，此时DNA终止合成，为细胞有丝分裂做好准备。氢分子处理后，Huh7细胞的G0/G1期细胞数显著减少(P<0.01)；S期细胞数增加，虽无显著性差异，但是柱状图呈现了上升的趋势；G2/M期细胞数显著增加(P<0.01)。说明氢分子处理Huh7细胞后，引起了细胞G2/M期阻滞，导致进入G0/G1期的细胞减少，进而影响了细胞的增殖。结合CCK-8法检测结果来看，流式细胞术检测得到的细胞周期结果与其相对应，说明氢分子可能是通过影响细胞周期从而抑制肿瘤细胞的增殖。

A：流式细胞仪周期结果图；B：氢分子对Huh7细胞周期的影响；**—H组与C组间的差异在P<0.01水平上具有统计学意义。

2.4 氢分子对肝癌细胞系细胞凋亡的影响

细胞凋亡即细胞程序性死亡，是细胞自主进行的死亡过程，肿瘤细胞由于基因突变等原因，通常具有一定的抗凋亡机制。为了进一步验证氢分子对肝癌细胞凋亡水平的影响，本实验按分组采用普通培养基和含氢培养基处理Huh7细胞24 h，通过流式细胞术检测Huh7细胞不同凋亡时期的变化，来探讨氢分子对Huh7细胞凋亡的影响。

图4表示氢分子对Huh7细胞凋亡的影响。与C组相比，氢分子处理后，Huh7正常细胞数显著增加(P<0.000 1)，早期凋亡细胞数基本没有变化，晚期凋亡细胞数显著增加(P<0.05)，坏死细胞数显著减少(P<0.000 1)，说明氢分子处理对Huh7细胞的主要作用可能是促进其晚期凋亡。凋亡实验结果表明，氢分子处理后，能够在晚期凋亡阶段促进肝癌细胞的凋亡水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

A：流式细胞仪凋亡结果图；B：氢分子对Huh7细胞凋亡的影响；*和****分别表示H组与C组间的差异在P<0.05和P<0.000 1水平上具有统计学意义。

2.5 氢分子对细胞悬浮克隆球形成的影响

通过统计克隆球形成数目即可对肝癌细胞样本及不同处理对其自我更新能力的影响进行分析。克隆球的形成率间接反映细胞系中干细胞的比例。按分组采用不含血清的普通培养基和含氢培养基培养悬浮克隆球，来研究氢分子对Huh7细胞克隆球形成的影响。图5表示氢分子对Huh7细胞克隆球形成的影响。Huh7细胞虽然能形成克隆球，但克隆球数量较少，与C组相比，H组的克隆球数量虽然有所减少，但没有显著性差异；与C组相比，H组的克隆球直径显著变小(P<0.000 1)。表明氢分子可以抑制Huh7细胞形成克隆球的数量和大小，进而说明氢分子对肝癌细胞的干性有一定的抑制作用。

2.6 氢分子对肝癌细胞系单克隆形成的影响

按分组采用不同培养基培养细胞，观察Huh7细胞形成克隆能力，以检验氢分子对Huh7细胞形成克隆的影响，探讨氢分子对肝癌细胞成瘤率的影响。结果如图6所示，加入氢分子后，Huh7细胞的克隆形成数显著减少(P<0.001)。实验结果表明氢分子能够显著抑制Huh7细胞在体外形成细胞克隆群，并且抑制肿瘤细胞的活性及无限增殖的能力，对癌症的进展具有一定的抑制作用。

A：细胞平板克隆染色图，染色深浅与细胞形成的克隆数量成正比；B：细胞形成克隆的计数图；*** 表示H组与C组间的差异在P<0.001水平上具有统计学意义。

2.7 氢分子对肝癌细胞系迁移的影响

肝癌难以治愈的重要原因就是其复发和易转移的特性，而肝癌的转移与肿瘤细胞的迁移能力密切关联。因此，采用划痕实验，按分组加入普通培养基和含氢培养基处理Huh7细胞，观察细胞迁移的情况，从而探讨氢分子对Huh7细胞迁移能力的影响。图7表示氢分子对Huh7细胞迁移能力的影响。经过24 h的继续培养，细胞开始向中间移动，Huh7细胞C组移动较快，加入含氢培养基后，细胞迁移能力显著降低(P<0.01)。结果表明氢分子处理后，Huh7细胞的迁移能力受到明显抑制，表明氢分子对肝癌的转移具有一定的抑制作用。

A：细胞划痕显微拍照；B：细胞迁移率；** 表示H组与C组间的差异在P<0.01水平上具有统计学意义。

2.8 氢分子对肝癌细胞系浸润的影响

通过迁移实验可以得知，氢分子能够抑制肝癌细胞形变移动。Transwell实验中，细胞若要模拟肿瘤细胞的侵袭作用既需要将胞外基质Matrigel通过自身分解酶类降解，又需要形变穿过小于自身体积的膜孔。因此，通过Transwell小室模拟肿瘤细胞在体内侵袭转移的过程，进一步验证加入氢分子对Huh7细胞的侵袭能力的影响，同时观察细胞侵袭的情况。

图8表示氢分子对Huh7细胞的侵袭结果，图A中染色越深说明细胞穿过基底膜的数量越多。染色结果显示，在普通培养基中的肝癌细胞侵袭能力较强，而含氢培养基中的细胞侵袭能力明显降低。细胞计数结果表明，H组的Huh7细胞穿孔细胞数较C组显著减少(P<0.000 1)，侵袭抑制效果非常明显。该实验结果表明，氢分子可能抑制Huh7细胞的侵袭能力，对肝癌的转移具有一定的抑制效果。该实验结果与细胞划痕实验相一致，说明氢分子能够抑制肝癌细胞的运动能力，从而抑制肿瘤的转移。

A：细胞显微拍照；B：细胞穿过小室计数图；**** 表示H组与C组间的差异在P<0.000 1水平上具有统计学意义。

2.9 氢分子对肝癌细胞系中波形蛋白表达的影响

波形蛋白(vimentin)作为细胞中间丝的一种，其动态性质对细胞的灵活性非常重要，波形蛋白分布情况为从细胞核到细胞膜放射状分布，在维持和调节细胞功能中有着重要作用，负责维持细胞骨架的完整性[26]。波形蛋白参与肿瘤细胞的分化、侵袭、转移和细胞凋亡等过程，多数研究表明波形蛋白表达与肿瘤的迁移和侵袭能力成正相关[27]。因此，通过细胞免疫荧光实验来研究氢分子对Huh7细胞波形蛋白表达变化的影响。如图9所示，经氢分子处理后，Huh7细胞明显皱缩，部分细胞坏死并呈现梭形，波形蛋白的表达量较C组明显下降。该实验表明，氢分子可能通过降低细胞中间丝波形蛋白的表达，继而影响Huh7细胞的粘附和形态。

图9 氢分子对Huh7细胞波形蛋白的影响Fig.9 Vimentin expression changes of Huh7 cells after H2 treated

3 讨论

目前，肝癌多采用药物治疗的方法，但仅能延长患者近5年的生存期，给患者的生活与家庭造成极大的痛苦和经济负担。因此，从社会公共卫生角度考虑，寻找有疗效、价格低的药物对癌症的预防和治疗至关重要。氢分子作为新型抗氧化剂，在多种疾病类型中取得良好的效果，并且较易获得，价格低廉[28]。现有研究证明，氢分子对一些肿瘤具有一定的治疗效果，如卵巢癌、大肠癌等[29-30]，因此，本研究应用肝癌细胞模型，在细胞水平探究氢分子对肝癌的治疗作用。本研究选择了人肝癌Huh7细胞作为体外研究目标，该细胞被广泛用于肝癌的生长、恶性表型、抗肝癌药物的药理药代和药物机理等研究。

本研究结果显示，氢分子可以改变Huh7细胞的细胞形态，抑制细胞在体外的增殖水平及肿瘤干细胞自我更新能力、无限增殖能力，降低细胞迁移和高度侵袭能力，并影响细胞周期，促进细胞凋亡，这些结果说明氢分子能够抑制肿瘤的生长和肝癌细胞的转移，并对肝癌的发生发展具有一定的防治作用。与常规的临床治疗手段相比，氢分子结构简单，制备安全经济，并且其安全无毒副作用的特点给未来研究带来很多便利[28]，也为患者提供了更好的生活质量。然而，本次研究只采用了体外细胞的实验结果，氢分子对肝癌的防治作用在体内的影响仍有待研究，下一步准备建立动物模型实验，进一步探究在肝癌的动物模型中，氢分子对肿瘤的影响，是否与体外结果相一致，可以达到抑制肿瘤生长和转移的效果。目前，除了含氢培养基处理细胞，动物供给呼吸也是一种方式，还有注射富氢生理盐水、氢气浴、氢气滴眼液以及肠道氢气介入等方式，目前都有相关研究[23]，氢分子给药的多样化为实验研究和患者生活都带来了效率。综上所述，氢气已经成为多种疾病治疗中非常有希望的选择，氢气的经济性与安全性也成为肿瘤治疗良好的辅助性手段。