柱前衍生—液质联用法快速测定葡萄中单氰胺残留

2020-07-30占绣萍黄兰淇陈建波朱卫芳

农药科学与管理 2020年3期

占绣萍，陈秀，黄兰淇，马琳，陈建波，朱卫芳，赵莉

(1.上海市农业技术推广服务中心，农业农村部农药质量监督检验测试中心(上海)，上海 201103；2.上海市青浦区农业技术推广服务中心，上海 201799)

单氰胺(cyanamide)是一种特殊的化合物，分子式为CH2N2，它是一种氨基氰。这种氰类化合物普遍都有着比较强的毒性，尤其是单氰胺这一种化合物，有着极强的生物腐蚀性。作为一种毒性较强的化学药物，单氰胺能够腐蚀人体皮肤组织，并且刺激呼吸道，以及呼吸道黏膜。一旦单氰胺中毒，就会使中毒者呼吸急促，头晕头痛等情况[1-4]。美国环境保护组织EPA将单氰胺列为高毒Ⅰ类危险农药[5]。

目前在国内市场登记的主要为50%单氰胺水剂，允许登记使用的作物为葡萄，并且不同厂家的产品毒性略不同，分别为低毒或中毒，它的主要作用是刺激葡萄的活性物质，致使新陈代谢所需的核苷酸合成减少，起到打破休眠、促进萌芽、提前成熟等生长调节作用，可促使作物萌动初期芽齐、芽壮，还可增加作物单产，改善品质等。根据本市地产草莓、葡萄使用植物生长调节剂对品质和质量安全的风险评估项目的开展，调查发现单氰胺也是上海葡萄种植户使用非常普遍的植调剂之一。并且在GB2763-2019 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量中也明确规定了葡萄中的最大残留限量为0.05mg/kg (临时限量)，因此迫切需要建立葡萄中快速、准确的检测单氰胺的残留方法。

单氰胺极易溶于水，使用常规有机溶剂难以提取，相对分子量小，浓缩过程易挥发，无特征吸收峰，遇酸碱不稳定，其残留检测极具挑战性。目前，单氰胺的检测还没有国家标准和行业标准，关于单氰胺的残留检测方法报道也较少，主要以柱前衍生间接测定为主。本文参照一些文献[6-10]的方法，进行不断的优化改进，只需进行简单的衍生处理，无需净化，即可满足残留检测要求，建立了一种在葡萄中相对简便、快速、高效、准确的单氰胺残留检测方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置 Agilent1290 UPLC-Agilent6460 MS/MS超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪：配ESI源，超声波(Jump Ultrasonic cleaning)，高速匀浆机(IKA T25 digital)；GB11240-89电热恒温水浴锅；AC-40氮吹浓缩器；国华SHAC恒温振荡器；TDL-5-A离心机；Milli Q超纯水系统；漩涡混合器(SCI LoGex MX-S)。

1.2 试剂及溶液的配制甲醇(色谱纯，德国Merck)，丙酮(色谱纯，TEDIA)，甲酸(色谱纯，美国Fluka)，高纯水，氯化钠(分析纯)；乙酸乙酯(分析纯)；单氰胺(纯度≥98%)和丹磺酰氯(DNS)标准品(纯度≥98%)。

5g/L DNS衍生剂：称取0.5g DNS，用丙酮溶解至50 mL。

碳酸钠溶液(0.2mol/L):称取0.53g碳酸钠，用水溶解并定容至25mL。

碳酸氢钠溶液(0.2mol/L):称取1.68g碳酸氢钠，用水溶解并定容至100mL。

碳酸钠/碳酸氢钠混合溶液(0.2mol/L，4+46):吸取4 mL 0.2mol/L碳酸钠水溶液，加入46 mL 0.2 mol/L 碳酸氢钠水溶液混合均匀。

单氰胺标准工作溶液：准确称取一定量的单氰胺标准品，用甲醇溶解定容至25 mL，转移到棕色标准品储备瓶中保存，然后再稀释至120 mg/L备用。临用前根据需要用丙酮稀释成0.000 3、0.003、0.03、0.15、0.3mg/kg 的单氰胺标准工作溶液。

1.3 样品前处理方法

1.3.1 提取准确称取粉碎后的葡萄样品5.0g ( 精确至0.01g) ，置于50 mL 塑料离心管中，补水1.0mL，然后加入25 mL 丙酮，并盖上盖子，涡旋振荡3 min，超声20min，以 4 000r/min 离心3min，待衍生化。

1.3.2 衍生化葡萄样品衍生化：取0.5mL 上清液于10mL离心管中，加入0.5mL碳酸钠/碳酸氢钠混合溶液，混匀后再加入0.5mL丹磺酰氯丙酮溶液，涡旋1min，于50℃水浴中静置衍生1h，衍生后，过0．22μm有机滤膜，待测。

单氰胺标准溶液也按照此方法同时进行衍生化。

1.4 检测条件

1.4.1 色谱条件色谱柱: Agielnt Eclipse Plus C18柱( 3.0 mm×150mm，3.5μm) ; 以0.1%甲酸水溶液( A 相) 和甲醇(B 相)=50+50为流动相进行等度度洗脱; 流速为0.4mL/min; 进样量: 2μL; 柱温: 40℃。目标化合物出峰时间为3.5min左右。

1.4.2 质谱条件采用AJS ESI源，ESI-电离模式，多反应监测(MRM)检测；雾化气压力：310.3kPa(40psi)；干燥气温度与流速：300℃，7L/min；鞘气温度与流速：350℃，12L/min；毛细管电压：负离子 3 500V。

表1 单氰胺的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的确定

2.1.1 提取剂的选择文献研究表明，单氰胺在水中溶解度高，但是提取不易浓缩，而且易提取出一些极性物质，影响衍生；单氰胺用乙腈提取，有机层衍生，回收率低，所以本研究不考虑水和乙腈做提取剂。本试验选取沸点低、对单氰胺有较高溶解度的丙酮、甲醇、乙酸乙酯等3种常用试剂来考察，再通过高速匀浆提取1min，用乙酸乙酯提取的需要加无水硫酸钠除水后衍生，其他试剂不需除水，直接衍生。结果表明，在丙酮、甲醇、乙酸乙酯3组试验中，单氰胺回收率均不足50%，回收率具体数据(表2)。原因可能是提取方式、提取时间不够，导致不能完全提取出该化合物。

表2 葡萄基质中采用不同提取剂时单氰胺的回收率

2.1.2 提取方式的选择根据2.1.1中提取剂筛选试验的结果，本试验首选用丙酮进行提取方式的进一步优化，匀浆1min、匀浆2min、超声10min 和超声20min。结果发现，超声20min，回收率能够满足要求。原因可能是超声波穿透作用强，加速了单氰胺从基质中萃取到大量溶剂中，而超声10min，穿透的时间还不够，导致回收率不够，所以本试验最终选择了自动超声20min的提取方式。需要注意的是建议使用扣盖的离心管，并且在管口和盖子接触的地方再用保鲜膜封一层，避免因为超声时间久、溶剂挥发，导致检测结果不准确。具体结果(表3)。

表3 葡萄基质中不同方式、不同时间提取单氰胺的回收率

2.2 质谱条件优化本试验基于三重四级杆串联质谱仪确立单氰胺衍生物的质谱条件，衍生产物分子量为275，质谱通过MS SCAN方式分别进行正、负离子模式全扫描，调节碎裂电压，发现正离子模式扫描方式下，可以得到较强的[M+H]峰母离子276，负离子模式扫描方式下，得到较强的[M-H]峰母离子274 。根据子离子扫描、MRM方式，正离子模式下得到丰度较好的2个碎片离子，分别为156.1(定量离子)、171.1(定性离子)；负离子模式下得到丰度较好的2个碎片离子，分别为258(定量离子)、230(定性离子)。经过比较，发现负离子模式出峰时间更快，并且灵敏度、峰形略优于正离子模式方式，因此本试验选择负离子模式MRM电离方式。0.1mg/kg的色谱图和碎片图谱正负离子模式(图1、2)。

图1 0.1mg/kg单氰胺的色谱图、碎片图(MRM/ ESI-)

图2 0.1mg/kg单氰胺的色谱图、碎片图(MRM/ ESI+)

2.3 结果计算试样中单氰胺的残留量以质量分数ω计，以mg/kg表示，按公式(1)计算：

(1)

式中：

A——试样溶液中单氰胺衍生物的峰面积；

As——标准溶液中单氰胺衍生物的峰面积；

ρs——标准工作溶液中单氰胺的质量浓度， mg/L;

V——提前液的总体积(提取有机溶剂体积加补水的体积再加上基质含水的体积)，mL；

m——试样的质量，g；

3——衍生稀释倍数。

计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，保留2位有效数字，当结果>1mg/kg时，保留3位有效数字。

2.4 回收率、精密度和定量限按0.001、0.01、0.05、0.1mg/kg 4个添加水平向葡萄样品中添加单氰胺，每个添加水平重复5次，并做空白对照。按本方法对样品进行处理和测定，考察单氰胺的回收率，具体结果(表4)。单氰胺在葡萄中的平均回收率为79.7%～92.9 %，相对标准偏差为3.6%～5.1%。可见该方法具有较高的回收率和较好的精密度，可以满足葡萄中单氰胺残留量检测要求。根据添加回收试验确定葡萄中单氰胺残留检测定量限为0.001mg/kg 。

表4 葡萄中单氰胺平均回收率和相对标准偏差(n=5)

2.5 线性方程取一定量的单氰胺储备液，用丙酮稀释成0.000 3、0.003、0.03、0.15、0.3 mg/kg 的标准工作溶液。按照1.3.2衍生化条件进行衍生，实际上机浓度为0.000 1、0.001、0.01、0.05、0.1mg/kg。以标样的浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制成单氰胺衍生物的标准曲线图，得到线性回归方程y = 3E+06x + 16 448，R=0.991，线性较好。

2.6 实际样品测定按所建立的方法对2019年抽取了上海散户种植的葡萄中单氰胺残留量进行测定。20个葡萄样品中有6个样品检测单氰胺残留，残留量为0.001 1～0.008 4mg/kg。对照最新发布的GB 2763-2019食品安全国家标准，葡萄中单氰胺MRL为0.05mg/kg(临时限量)，检出的6个样品均未超标。