农药登记环境影响试验试材使用现状及管理建议

袁善奎，单炜力，周艳明，周欣欣，陈 朗

(农业农村部农药检定所，北京 100125)

自2014年GB/T 31270《化学农药环境安全评价试验准则》系列国家标准[1]发布以来，我国农药环境安全性测试相关的标准方法每年均以10项左右的速度增长。截止2019年9月，已制定用于农药登记的环境安全性测试标准试验方法相关标准47项，其中：环境归趋类15项、生态毒理学类32项，已初步形成较为完善的标准方法体系，基本覆盖现行《农药登记资料要求》[2]中的农药环境影响试验项目，成为农药环境风险评估体系的重要技术支撑。不同类型的环境生物及土壤试材是农药环境影响试验中的基本试材。生物试材及土壤试材的质量是获得科学、可靠试验数据的重要因素。不同实验室间试验试材的来源、饲育与培养设施、培养方法与环境等是否一致关系着数据的可重复性与可比性。欧洲实验室动物科学协会联合会于2007年专门发布了针对用于标准化测试和其他科学研究目的的动物饲育管理指南[3]。我国目前在农药环境影响试验试材管理方面尚处于起步阶段。

本文归纳总结了国内外农药环境影响试验准则中对试验试材的要求，并针对我国农药登记环境影响资料要求涉及的土壤试材和11类生物试材在国内各相关实验室的使用情况进行了调研，旨在分析农药环境影响试验试材使用中存在的问题并提出解决方案，进一步提高生物试材和土壤试材的规范化水平，提高农药环境影响试验数据的质量。

1 国内外农药环境影响试验试材基本要求

1.1 生物试材及其规范化要求 现行《农药登记资料要求》[3]中，生态毒理学试验资料涉及鸟类、鱼类、蜜蜂、家蚕、大型溞、绿藻、蚯蚓、赤眼蜂、瓢虫、浮萍、穗状狐尾藻等11个生物类型。在测试生物数量方面，由于现阶段生态保护目标的差异，我国要求测试的生物类型及测试物种均少于美国[4]及欧盟[5]的要求，比如暂未规定对底栖生物、海洋生物影响的资料要求，对鱼类和鸟类的测试种类数量也相对较少。在测试物种方面，除中国特有生物物种(如家蚕)和部分天敌生物(如赤眼蜂)，鱼类、鸟类、蜜蜂、蚯蚓、大型溞、绿藻等试材在物种方面国内外要求基本一致。

客观上，由于生态毒理学试验涉及的生物试材种类多、个体小、繁殖快、部分品种贮存与运输困难，在规范化管理方面不易像毒理试验中类似小白鼠等试验动物这样进行标准化管理。为了提高试验数据的可靠性、可比性和重复性，试验准则中[1，6]通常对试验生物的健康状况、体重、体长、雌雄比例(如鹌鹑)、生长季节(如蜜蜂)以及培养条件等进行规定。生物试材健康状况良好，前述指标在相关试验准则规定的范围之内，则理论上认为其合乎要求。此外，OECD和国内的试验准则[1，6]大多还规定了周期性参比物试验作为质控要求。例如，以重铬酸钾作为参比物，要求其对斑马鱼24h急性毒性LC50在200～400 mg/L之间，对大型溞24h急性毒性EC50在0.6～2.1 mg/L之间；以乐果作为参比物，其对蜜蜂48h急性经口毒性LD50应在0.20～0.30 μg/蜂之间，48h急性接触毒性LD50应在0.20～0.35 μg/蜂之间，0.2 g/ha施用量条件下对七星瓢虫的急性致死率应在40%～80%之间；以氯乙酰胺为参比物，对蚯蚓的14d急性毒性LC50应在20～80 mg a.i./kg干土范围内。除上述试验项目外，目前尚有10余个生态毒理试验标准未推荐参比物，或未明确参比物的毒性终点范围。国内制定的意大利蜜蜂幼虫发育试验准则中，推荐了乐果和苯氧威作为参比物，家蚕试验也推荐了乐果作为参比物，但未给出可参考的参比物毒性范围。

1.2 土壤试材及其规范化要求 OECD系列试验准则[6]中，土壤降解试验要求土壤质地为砂质壤土、粉壤土、壤土或壤质砂土；pH范围为5.5～8.0；土壤有机碳含量为0.5%～2.5%；微生物量>总有机碳的1%。土壤吸附和土壤淋溶试验对土壤的要求(表1、表2)。土壤表面光解试验(草案)要求使用粉壤土或粘壤土。欧盟农药原药资料要求(EC 283/2013)[5]中规定:用于降解、吸附/解吸附或迁移研究的供试土壤应具有代表性，在有机碳含量、粒径分布和pH方面具有一定差异；当降解或迁移可能与pH有关时，供试土壤应涵盖特定的pH范围(5～6、6～7、7～8)。

表1 OECD土壤吸附试验准则对土壤的要求[6]

表2 OECD土壤淋溶试验准则对土壤的要求[6]

美国EPA制定的环境归趋试验报告评审指南[7]中规定：土壤代谢试验应使用4种能代表农药使用区域的土壤，有机碳含量、pH、粘粒含量和微生物量应有一定差异。土壤吸附试验至少使用5种农药使用区域的代表性土壤或沉积物。其中一种土壤的有机质含量低于1%。

我国现行《农药登记资料要求》[2]中，土壤好氧代谢、厌氧代谢、表面光解、吸附、淋溶试验，以及农药在土壤中的分析方法与验证等6项环境归趋测试以及土壤微生物毒性测试需要使用土壤试材。根据GB/T 31270[1]，土壤降解试验、表面光解试验、吸附试验、淋溶试验和微生物毒性试验等5个试验均要求使用天然土壤，推荐使用红壤土、水稻土、黑土、潮土、褐土等5类土壤。具体土壤类型及其理化性质要求(表3)。

表3 我国农药登记环境归趋试验准则对土壤的要求[1]

总体而言，有机碳含量、pH、粘粒含量和微生物量等4个土壤参数是影响试验测定结果的重要因素，但由于微生物量的控制较难，国外的试验准则主要基于前3个因素进行规定，并要求试验选择的不同类型的土壤应体现这3个因素的差异。归纳起来，OECD准则中上述因素的取值范围为：pH，(<4.0)～(>7.5)；有机质含量，(<0.5%)～(>10%)；粘粒含量，(<10%)～ 80%。

2 我国农药登记环境影响试验试材使用现状

2.1 生物试材 我国农药登记环境影响试验中常用的生物试材有11类25种[2]。对25家实验室的问卷调查结果表明，除鸟类(日本鹌鹑)、蜜蜂(意大利蜜蜂)、溞类(大型溞)、穗状狐尾藻、蚯蚓(赤子爱胜蚓)、捕食性天敌(七星瓢虫)采用统一物种外，其他生物类别各实验室采用的物种均有所不同。其中，鱼类主要采用斑马鱼，占90%以上，其他测试物种包括鲤鱼、虹鳟鱼、稀有鮈鲫、日本青鳉等；淡水绿藻主要采用羊角月牙藻，其次为斜生栅列藻，少数使用普通小球藻；浮萍主要采用紫背浮萍(占64%)，其次是小浮萍，个别采用圆瘤浮萍；家蚕以菁松×皓月蚕种为主(占67%)，部分实验室采用了春蕾×镇珠、苏菊×明虎等其他具有代表性的蚕种；寄生性天敌主要采用玉米螟赤眼蜂(占74%)，少数采用松毛虫赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂、舟螟赤眼蜂、螟黄赤眼蜂等。

各实验室试材来源渠道差异也较大，导致生物试材的生物学背景信息相差较大。大型溞、绿藻、浮萍、穗状狐尾藻、蜜蜂、蚯蚓、瓢虫、赤眼蜂及少数实验室的斑马鱼等主要是通过外部引种后在实验室内自行扩繁；鸟类、鱼类、家蚕等繁殖周期相对较长的试材通常为直接购买，验收合格后用于试验。具备资质的专业的试材提供机构通常能够为实验室出具试材品系证书，并提供详细的培养过程，例如，中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻类库。科研单位或大型养殖机构所提供的试材品种信息较为可靠，但无法提供品系证书，这是目前大多数外购试材的供应渠道，例如，从中国农科院植保所购买赤眼蜂和瓢虫卵卡等。而从市场或者网络购买的试材则生物学信息可靠性较差，例如，部分单位从市场上购买观赏斑马鱼用于试验、从天猫商城购买七星瓢虫卵卡用于试验。还有部分实验室直接从野外采集试材，例如穗状狐尾藻、瓢虫、浮萍等，经纯化后在实验室内进行扩繁和试验。此外，还存在实验室之间相互提供试材的情况，例如大型溞、绿藻、瓢虫等。

生物试材的价格也在一定程度上反映了试材的质量，标准的生物试材价格远远高于市场上普通流通的试材，但不同地区、不同供货机构的价格客观上也存在差异。

2.2 土壤试材 GB/T 31270[1]规定的红壤、水稻土、黑土、潮土、褐土均属于《中国土种志》[8]中耕型面积排前十的土类目前，国内环境归趋实验室所采用的土壤试材基本都是实验室间相互提供或委托其他单位采集，并委托专业机构或自行进行理化参数测定。

3 试材规范化管理中存在的问题

3.1 生物试材 首先，大多数生物试材遗传背景不清楚。从调查情况来看，各实验室的生物试材来源渠道多样化，仅少数生物试材有相关证书。这可能导致试验数据的可比性和可重复性较差。例如，部分市场上的斑马鱼品种可能是为了增强观赏价值而改造的杂交品种。

其次，一部分生态毒理学试验尚未建立参比物测试方法。目前国内现行生态毒性试验准则中仅有9个试验推荐了参比物及其毒性终点范围。其余试验尚未建立参比物试验方法，或推荐了参比物但缺少可参考的毒性终点范围，从而无法对生物试材的质量进行检验。

再次，缺少统一的生物试材培养方法指南。虽然现有的生态毒理学测试准则中分别描述了各自使用的生物试材培养条件，但对培养的具体细节，尤其是对试材的健康检验检查方面规定较少，客观上造成了生物试材在不同实验室内的驯养条件差异较大，进而影响实验室间毒性测试结果的可比性。

最后，对本土物种方面的研究和探索仍有待加强。从国内现有试验准则和调研情况来看，虽然测试的生物物种与OECD准则一致有利于未来推进政府间的数据互认，但进行农药高级阶段的环境风险评估过程中，例如开展物种敏感性分布(SSD)测试时，应增加本土物种的测试，以进一步明确农药在我国特定环境和场景下使用时的实际风险。但是，从各实验室目前饲养的生物试材种类来看，本土物种的储备较少，不利于开展该类试验。

3.2 土壤试材 首先，土壤类型缺少权威鉴定机构。GB/T 31270[1]推荐的土壤是按GB/T 17296《中国土壤分类与代码》[9]中的土类进行分类，目前尚无可出具检测报告的有资质单位，主要依靠专家个人经验判断。其次，现有准则未对土壤的机械组成指标进行规定。按GB/T 17296[9]，同一土类中又分为若干亚类、土属、土种，其土壤理化性质会有差异。例如，不同成土母质的红壤的机械组成会存在显著差异，而GB/T 31270[1]仅规定了土壤有机质含量和pH，未规定土壤机械组成方面的要求。最后， GB/T 31270[1]中对土壤的个别指标规定与我国典型土壤实际指标不一致(例如，规定黑土有机质含量为2%～3%，而黑土实际中有机质含量一般均高于3%)，造成实际试验过程中很难获得在土壤类型和理化性质参数方面均满足准则要求的样品，导致各实验室土壤样品使用随意、试验结果可重复性差。此外，土壤理化参数的差异变化范围太窄，不能全面反映不同pH和有机质含量对农药环境归趋行为的影响。

4 解决措施和建议

首先，应规范或统一试材来源渠道。一是对各农药登记环境影响实验室的生物试材引种提出遗传背景方面的规范化要求；二是可行时，针对部分试材建立统一的供应渠道，由有资质的试材供应单位提供试材，例如土壤试材，选择符合要求的采样位点作为固定地点，统一采样供应给实验室，并提供理化参数证明。

其次，加强试验试材的规范化研究。一是加快部分生态毒理学试验的参比物测试方法研究，确定参比物种类及其毒性终点参考范围；二是丰富测试物种，加强对底栖生物、海洋生物等的敏感性、试材培养与规范化研究，并积极探索典型本土物种的规范化饲养。

最后，继续完善农药环境影响试验方法体系。一是修订现有试验准则，完善参比物试验要求，参考国外经验修改土壤参数要求(仅要求所选择的土壤能代表生产上的主要土壤类型，体现不同土壤在有机碳含量、pH、粘粒含量等参数方面的差异，而不应将土壤类型与具体参数值相关联)等；二是加快制定生物试材规范化饲养与管理标准；三是必要时，针对新的保护物种(包括本土生物)，开发与建立标准化的毒性测试方法。