基于相关性的麻黄配方颗粒HPLC特征图谱研究

王迎春 麻景梅 王梦 曹文利 李军山 牛丽颖

摘 要：为更好地评价麻黄配方颗粒、饮片和水煎剂的一致性，分别建立麻黄配方颗粒、饮片和水煎剂的HPLC特征图谱，使用Wondasil C 18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，分别得到10批麻黄配方颗粒、饮片和水煎剂的特征图谱，并进行关联性分析。结果表明，麻黄配方颗粒HPLC特征图谱中的13个共有峰均能在水煎剂中得到追踪，11个共有峰可在饮片中得到追踪。经方法学考察认为，所建立的麻黄配方颗粒HPLC特征图谱方法稳定，具有较高的重复性、稳定性及可信度，可用于麻黄配方颗粒、饮片和水煎剂的一致性评价，也可为麻黄配方颗粒的质量控制提供参考。

关键词：中药化学;特征图谱;麻黄配方颗粒;麻黄饮片;麻黄水煎剂;相关性

中图分类号：R917 文献标识码：A

doi： 10.7535/hbgykj.2020yx04012

文章编号：1008-1534（2020）04-0286-05

Abstract：In order to better evaluate the consistency of Ephedra formula granules， decoction pieces and aqueous decoction， the HPLC characteristic chromatograms of them were established respectively. The analysis was performed on Wondasil C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with acetonitrile -0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase for gradient elution . The column temperature was maintained at 30 ℃， the flow rate was set at 1.0 mL/min and the detection wavelength was 210 nm. The HPLC characteristic chromatograms of 10 batches of Ephedra formula granules， decoction pieces and aqueous decoction obtained were established and their correlation analysis was carried out. The results show that 13 common peaks in the HPLC characteristic chromatograms of Ephedra formula granules can be tracked in the aqueous decoction， and 11 common peaks can be tracked in the decoction pieces. The methodology study proves that the method for the HPLC characteristic chromatograms of Ephedra formula granules is stable， with high repeatability， stability and credibility. It can be used for the consistency evaluation of Ephedra formula granules， decoction pieces and aqueous decoction， which also provide reference for the quality control of Ephedra formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese materia medica; characteristic chromatograms; Ephedra formula granules; Ephedra decoction pieces; Ephedra aqueous decoction; correlation

麻黃始载于《神农本草经》，为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf、中麻黄Ephedra intermediate Schrenk et C.A.Mey.或木贼麻黄Ephedra equisetina Bge.的干燥草质茎[1]，是中国临床常用的中草药。现代研究表明，麻黄中含生物碱类、黄酮类、挥发油、有机酚酸、糖类及鞣质等多种化学成分，其中生物碱是麻黄的有效成分，具有平喘、利尿、镇痛、兴奋中枢神经系统等作用[2-4]。

传统中药煎煮耗时、携带不便的缺点与人们快速的生活节奏之间的矛盾日渐突出，中药配方颗粒的出现，弥补了传统中药饮片的不足。中药配方颗粒是参照传统中药煎煮方式，以单味饮片为原料，采用水煎提取后，经过一系列现代加工工艺制备而成的，具有免煎易服、携带方便等优点[5-7]。中药配方颗粒的药效物质应与中药饮片水煎剂保持基本一致，本实验通过对麻黄配方颗粒、麻黄饮片、水煎剂三者特征图谱的研究，从化学成分上对比分析三者的差异，从而为麻黄配方颗粒的质量评价及控制提供参考。

1 主要仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪：Ultimate 3000，DAD检测器，变色龙色谱工作站，美国赛默飞公司提供;色谱柱：Wondasil C 18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），日本岛津公司提供;电子天平：TB-215D（十万分之一）、BSA224S-CW（万分之一），德国赛多利斯公司提供;旋转蒸发器：RE-3000型，上海亚荣生化仪器厂提供;冷冻干燥机：FILOT5-8L，北京博医康实验仪器有限公司提供。

1.2 试剂

盐酸麻黄碱对照品（批号：0714-201007）、盐酸伪麻黄碱对照品（批号：171237-201208），购自中国食品药品检定研究院;甲醇（色谱级）和乙腈（色谱级），Fisher化学试剂公司提供;磷酸（分析级），天津市风船化学试剂科技有限公司提供;水为超纯水。

1.3 饮片、配方颗粒

10批麻黄饮片（编号为Y1—Y10）分别来自内蒙古（3批）、辽宁（2批）、河北（3批）、山西（2批），经神威药业集团有限公司（以下简称神威药业）质量检测中心鉴定为草麻黄（Ephedra sinica Stapf）的干燥草质茎。

10批麻黄配方颗粒（编号为K01—K10）中K01—K06为中试小样，K07—K10为中试成品，批号分别为18062931，18071331，18082831，18041731，神威药业提供。

2 实验部分

以麻黄配方颗粒、饮片、水煎剂为研究对象，参考文献[8—15]设计实验方案。

2.1 麻黄水煎剂的制备

取麻黄饮片100 g，煎煮2次，一煎加水1 000 mL，浸泡30 min，保持微沸20 min，趁热过滤;二煎加水800 mL，保持微沸15 min，趁热过滤，将2次药液混合，减压浓缩（温度50 ℃）至约200 mL的浸膏，冷冻干燥得干膏粉。

2.2 对照品溶液的制备

取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶解定容，制成每1 mL含盐酸麻黄碱43.36 μg和盐酸伪麻黄碱21.67 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1麻黄配方颗粒供试品溶液的制备

取研细的麻黄配方颗粒约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%（体积分数，下同）甲醇50 mL，并滴加1滴磷酸，密塞，摇匀，称定质量，超声提取20 min后取出（功率250 W，频率35 kHz），放至室温，再次称定质量，减失的质量用70%的甲醇补足，摇匀，滤过，即得。

2.3.2 麻黄水煎剂供试品溶液的制备

按“2.1”项下麻黄水煎剂的制备方法制备干膏粉，取干膏粉约0.1 g，精密称定，按“2.3.1”项下方法制备，即得。

2.3.3 麻黄饮片供试品溶液的制备

取适量麻黄饮片，粉碎，过4号筛，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按“2.3.1”项下方法制备，即得。

2.4 色谱条件

色谱柱为Wondasil C 18 柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm ）;流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱;流速为1.0 mL/min;检测波长为210 nm;柱温为30 ℃;进样量为10 μL。洗脱条件见表1。

2.5 方法学考察

依据“2.3.1”项下的供试品制备方法制备麻黄配方颗粒（批号：18062931）供试品溶液（以下简称麻黄配方颗粒供试品溶液），按照“2.4”项下的色谱条件，分别进行精密度试验、重复性试验和稳定性试验。

2.5.1 精密度試验

对同一份麻黄配方颗粒供试品溶液连续进样测定6次，将主要特征峰的保留时间和峰面积分别与盐酸麻黄碱峰的保留时间和峰面积进行对比，所得各峰的相对保留时间RSD为0.09%～0.27%，相对峰面积RSD为0.66%～2.83%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验

平行制备6份麻黄配方颗粒供试品溶液分别进样测定，将主要特征峰的保留时间和峰面积分别与盐酸麻黄碱峰的保留时间和峰面积进行对比，所得各峰的相对保留时间RSD为0.04%～0.30%，相对峰面积RSD为1.34%～2.87%，表明方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验

取同一份麻黄配方颗粒供试品溶液分别于0，4，8，12，24 h时进样测定，将主要特征峰的保留时间和峰面积分别与盐酸麻黄碱峰的保留时间和峰面积进行对比，所得各峰的相对保留时间RSD为0.05%～0.31%，相对峰面积的RSD为0.74%～2.77%，表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.6 特征图谱的建立及相关性分析

2.6.1 特征图谱的建立

按“2.4”项下的色谱条件，分别将10批麻黄配方颗粒供试品溶液注入高效液相色谱仪进样测定，将10批麻黄配方颗粒特征色谱图以AIA格式导入“中药指纹图谱相似度评价系统（2012）”软件，进行自动匹配，生成麻黄配方颗粒HPLC特征图谱（见图1），10批麻黄配方颗粒HPLC特征图谱（见图2），其相似度见表2。由图表可知，10批麻黄配方颗粒特征图谱的相似度均在0.96以上，10批麻黄配方颗粒有13个共有峰，经与混合对照品色谱图对比，指认4号峰为盐酸麻黄碱，5号峰为盐酸伪麻黄碱。盐酸麻黄碱是麻黄的主要成分之一，该色谱峰分离度较好，响应强度大，因此选择盐酸麻黄碱为参照峰。

采用相同方法分别建立麻黄饮片和水煎剂的HPLC特征图谱并进行相似度评价，色谱图见图3和图4，相似度见表2。由结果可知，10批麻黄饮片特征图谱的相似度均在0.87以上;10批麻黄水煎剂特征图谱的相似度均在0.95以上。

2.6.2 特征图谱的比较

比较麻黄饮片、水煎剂、配方颗粒对照特征图谱（见图5），三者有11个共有峰，采用相似度评价软件计算三者的相似度，结果见表3。结果表明，三者相似度均在0.90以上。麻黄配方颗粒13个特征峰在水煎剂中均能得到追踪，说明麻黄配方颗粒和水煎剂的化学成分基本一致。麻黄饮片因用甲醇提取，所含成分较水煎剂和配方颗粒多，色谱峰的分离度较配方颗粒和水煎剂小，峰型较差，但主要特征峰的数目与配方颗粒和水煎剂基本一致。

3 讨 论

麻黄水煎剂的煎煮方法参照《医疗机构中药煎药室管理规范》进行，分别考察了加水量为8倍、10倍和12倍水时的出膏率，以及干膏粉中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量，最终确定加水量为一煎加10倍水，二煎加8倍水。

由于麻黄配方颗粒是麻黄饮片水提后经一系列工艺加工而成，因此选择甲醇作为提取溶剂、超声提取，来制备麻黄配方颗粒的供试品溶液。试验中考察了不同浓度的甲醇（50%，70%，100%）对提取效果的影响。用100%甲醇提取的麻黄配方颗粒供试品溶液色谱峰峰型及分离度较差，且盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量较低;50%甲醇提取的供试品溶液基线略飘，70%甲醇的提取效果最好。

试验中还考察了超声提取时间（20，30，40 min）对提取效果的影响。结果表明，超声提取时间为20，30，40 min的提取效果差别不大，故选择超声提取时间为20 min。

本试验采用DAD检测器对检测波长进行了考察，分别在210，230，240，254 nm波长下进行试验，通过比较基线平稳程度、色谱图信息量、出峰时间等，最终选定检测波长为210 nm。

流动相分别考察了甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸，对比两者梯度洗脱效果，乙腈-0.1%磷酸作为流动相的色谱图基线平稳，色谱峰分离效果更优。

4 结 语

本试验采用HPLC-DAD建立的麻黄配方颗粒特征图谱方法稳定、重复性好。麻黄配方颗粒HPLC特征图谱中的13个共有峰，其中11个共有峰可在饮片中得到追踪，13个共有峰均可在水煎剂中得到追踪。麻黄饮片特征图谱中10号峰在配方颗粒和水煎剂中缺失，可能是麻黄饮片经过高温提取、浓缩等一系列加工后分解，转化为其他成分。10批麻黄配方颗粒、水煎剂、饮片的特征图谱基本一致，特别是麻黄配方颗粒和水煎剂特征图谱的相似度在0.900以上，这表明麻黄配方颗粒中的主要化学成分与其水煎剂中的化学成分基本相同，可为麻黄配方颗粒的临床应用提供参考。

本研究只指认了特征图谱中的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱2个特征峰，后续还需进一步指认其余特征峰，以获得更多信息，从而更好地监控麻黄配方颗粒的质量。

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