痰Xpret MTB/RIF和血T-SPOT.TB对老年肺结核的临床诊断价值

2020-07-29武桂萍曹文利邬俊峰徐伟

医学综述 2020年14期

武桂萍，曹文利，邬俊峰，徐伟

(北京老年医院感染疾病科,北京 100095)

相关研究显示，2012年全世界范围内新发结核病患者860万例，依据全国第五次结核病流行病学抽样调查显示，我国15岁以上人群活动性结核病患者达499万例[1-2]。控制结核病的主要环节是控制传染源，治愈现症肺结核患者，而控制结核的关键为快速诊断。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)涂片的抗酸染色镜检是临床诊断结核病最常用的方法，但其检测的灵敏度较低；液体培养可提高灵敏度，但结果的回报时间较长，无法满足对结核病流行病学的控制[3]。

近年来，免疫学技术与分子生物学的发展，为MTB耐药性检测与结核病快速诊断提供了新方法。控制结核传播的关键环节为结核病的早诊断与早治疗，因此寻求一种合理有效的诊断方法以提高结核病确诊率十分重要。Xpret MTB/利福平耐药基因检测(rifampin resistance gene detection，RIF)为新型利福平耐药性分析与MTB感染分子诊断平台，由美国Cepheid公司研发，当前临床对于该分子诊断技术关注度较高[4-5]。结核感染T细胞斑点试验(tuberculosis infection T cell spot test，T-SPOT.TB)主要依据MTB的抗原特性，对单个核细胞分解γ干扰素后所产生的刺激量来判别其是否有MTB感染。本研究主要分析痰Xpret MTB/RIF和血T-SPOT.TB对老年肺结核患者的临床诊断价值，为患者诊疗提供借鉴。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2017年2月至2019年2月北京老年医院感染疾病科收治的162例疑似老年肺结核患者为研究对象，患者均经临床最终确诊。诊断标准：①典型肺结核临床症状和胸部X线及CT表现；②抗结核治疗有效；③临床可排除其他非结核性肺部疾患；④结核菌素试验强阳性，血清抗结核抗体阳性；⑤痰结核菌聚合酶链反应和探针检测呈阳性；⑥肺外组织病理证实结核病变；⑦支气管肺泡灌洗液中检出抗酸分枝杆菌；⑧支气管或肺部组织病理证实结核病变。具备①～⑥中3项或⑦～⑧中任何1项可确诊。

1.2方法取患者2份下呼吸道的合格痰样本，一份进行MTB快速培养和金胺法抗酸染色，另一份进行Xpret MTB/RIF试验；取肘静脉血5 mL，应用肝素锂进行抗凝，进行T-SPOT.TB检测。

1.2.1Xpret MTB/RIF试验试剂盒购自美国Cepheid公司(批号：1404C186)，将所采集患者下呼吸道痰样本置入样本处理液(痰液2倍体积)，混匀后在室温下静置10 min，选取2 mL置入试剂盒内，放置于4通道的Gene Xpert平台内自动运行。2 h 后自动读取利福平的耐药结果与MTB检测结果。读取结果是“no result”“error”或“invalid”时重复检测一次，根据MTB检测结果即探针循环阈值判断：当内对照探针Ct值≤38为阳性，对照探针Ct值>38为阴性。

1.2.2SPOT.TB检测试剂盒购自英国Oxford公司(批号：TEC260478)，取患者肘静脉血5 mL，应用肝素锂进行抗凝，随后分离单个核细胞，洗涤后对细胞计数；培养滤液蛋白10、结核特异抗原前期所分泌抗原靶蛋白6及单个核细胞，同时置入预包被的有γ干扰素抗体反应孔内，在含5% CO2、37 ℃下孵育过夜，次日置入二抗，孵育1 h洗板，底物置入后采用显色液孵育5 min，蒸馏水终止反应，记录斑点形成细胞数，每个斑点表示1个效应T淋巴细胞。判读结果：阴性对照孔的斑点数≥6，孔斑点数检测≥2倍阴性对照孔斑点数则判定为阳性；阴性对照孔斑点数<6。

1.3MTB快速培养及抗酸染色依据BACTEC MGIT 960分歧杆菌分析系统手册[6]及《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[7]行相关操作。痰涂片行金胺法抗酸染色，结果依据《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[8]进行判断。

1.4统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)，特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)，准确度= (真阳性+真阴性)/总例数，阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)，阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1金标准诊断结果 162例疑似老年肺结核患者中，根据胸部CT、手术活组织检查、痰培养及临床症状等指标最终确诊肺结核患者88例，阳性率为54.32%；非肺结核患者74例，包括细菌性肺炎34例，慢性支气管炎21例，慢性阻塞性肺炎11例，其他8例。

2.2痰Xpret MTB/RIF和T-SPOT.TB诊断效能比较痰Xpret MTB/RIF共检出阳性40例，阴性122例，T-SPOT.TB共检出阳性110例，阴性52例，见表1。痰Xpret MTB/RIF和T-SPOT.TB诊断老年肺结核的灵敏度分别为45.45%、93.18%，特异度分别为100.00%、62.16%，Xpret MTB/RIF诊断肺结核灵敏度低于T-SPOT.TB，特异度高于T-SPOT.TB(χ2=4.506，P=0.038；χ2=5.690，P=0.014)，见表2。

表1 痰Xpret MTB/RIF和T-SPOT.TB的检查结果 (例)

3 讨论

我国为全世界主要的结核病高负担国家，流行病学研究显示，我国新发病患者数为130万例，仅次于印度[9]。我国第五次结核病流行病学抽样调查显示，菌阳肺结核、涂阳肺结核与活动性肺结核的患病率分别为119/10万、66/10万及459/10万，其中男性菌阳肺结核、涂阳肺结核及活动性肺结核的患病率均高于女性，且结核病发病率随着年龄的增长而升高[10]。当前，临床对于诊断肺结核的金标准为结核菌培养，但周期过长，假阳性与假阴性的比例较高，而且对于肺外结核患者与菌阴患者诊断困难。

结核菌素试验的操作简便且价格低廉，临床应用广泛，但由于受交叉反应和免疫力情况影响，其特异性与敏感性较低。常规聚合酶链反应对结核感染进行检测，需要扩张后行电泳，速度快，但无法定量且容易发生交叉感染，特异性较低。实时荧光定量聚合酶链反应方法为近年兴起的结核确诊方法，可定量检测DNA，其因具有准确率高及速度快等优势而在临床广泛应用，但其标本来源不易获得，所以此方法受到了一定制约。痰涂片为一种操作简便、费用低、诊断快速、在临床广泛应用的肺结核诊断方法，但该方法对死活菌和非MTB取法的区分受制于痰液内分枝杆菌的数量，所以诊断敏感性低，漏检人数增加，且无法诊断肺外结核患者，临床应用也受到一定的制约。既往临床对结核病的诊断多依据患者痰涂片的抗酸染色，但痰涂片对于标本含菌量的要求较高，造成对结核病患者诊断敏感性较低的因素主要为肺结核患者中多数为涂阴肺结核。临床缺少细菌学的诊断，对于菌阴肺结核诊断比菌阳肺结核困难，所以临床对肺结核有误诊现象[11]。

MTB感染者外周血单核细胞内存在MTB特异性活化T淋巴细胞，上述淋巴细胞在受到MTB特异性抗原刺激后分泌γ干扰素，培养滤液蛋白10及6 kDa 早期分泌性抗原性靶为MTB复合群基因内RD1区域rv3874及rv3875编码结核特异性蛋白抗原，能够从结核感染者T细胞内诱导出较强的γ干扰素释放反应，并以此设计了T-SPOT.TB，能够推测体内是否有对MTB反应的效应T细胞，进而进行诊断。同时无论患者是否有临床症状，检测效应T淋巴细胞在血清内含量均可以作为机体是否被感染的指标，效应T淋巴细胞的存活期较短，多在病原体被消灭后消失。T-SPOT.TB检测血清抗原特异T淋巴细胞及γ干扰素最敏感，基本不受CD4+T淋巴细胞数量少的影响，此方法对于临床结核病合并免疫缺陷患者比较适宜[12-13]。T-SPOT.TB主要检测培养滤液蛋白10所导致T细胞介导γ干扰素反应及MTB所分解的6 kDa早期分泌性抗原性靶剂量，其对菌阴结核病和前期结核病患者诊断价值较高[14-15]。本研究结果显示，T-SPOT.TB诊断老年肺结核的灵敏度为93.18%，特异度为62.16%，且灵敏度远高于痰Xpret MTB/RIF，故认为此方法对肺结核的辅助诊断价值较高，具有一定的临床应用价值；其灵敏度高，特异度相对较低，提醒广大临床医师在诊断活动性肺结核时，不能仅凭T-SPOT.TB阳性做出诊断，还应结合患者的临床表现、影像学及痰检结果等进行综合判断。

Xpret MTB/RIF试验为世界卫生组织所推荐的结核病检测分子诊断平台，其技术基础为半巢式实时荧光聚合酶链反应，靶序列为rpoB基因利福平耐药决定区内81 bp核心区，2 h内能够检测出利福平与MTB耐药性，利福平的单药耐药较少，临床一般将利福平耐药作为耐多药结核病的标志物。有研究显示，Xpret MTB/RIF对于肺外结核病诊断价值较高，其特异度为0.99，灵敏度为0.78[16]。Xpret MTB/RIF在2 h内即可检测出是否存在阳性现象，所以相对于痰液培养优势显著。另外，夏辉和赵雁林[17]对我国应用Xpret技术前景分析建议将Xpret技术整合至我国的结核病防治规划中。Xpret MTB/RIF能够对MTB核酸直接检测，还可检测出利福平耐药性，这对于快速诊断耐药结核病价值较高，同时操作简便，可避免基因检测所出现的污染等问题[18]。本研究结果显示，痰Xpret MTB/RIF诊断老年肺结核的灵敏度为45.45%，特异度为100%。故能从病原学证据上快速诊断肺结核，而且还能检测出是否对利福平耐药，对临床有重要的指导意义。但痰Xpret MTB/RIF技术与痰涂片一样无法区分结核杆菌是否存活，故存在一定的假阳性[19-20]。