黑臭河道修复菌

何煦妍

◎研究背景

我出生在河网密集的珠江三角洲，从小就在纵横交错的河道边长大。但在我十几年的记忆中，这些河道大部分都流淌着像墨水一样的河水，还散发着阵阵难闻的气味。为了给河流治病，我上网查阅了大量文献资料，了解到电缆细菌极有可能是加速河道黑臭治理的重要微生物！经过请教老师和专家后，我推测：受严重污染的黑臭河道沉积物中也存在电缆细菌，但由于长期的污染胁迫，这些电缆细菌具有相对独特的系统分类地位;通过调节上覆水体的电子受体将能有效提高黑臭河道沉积物中电缆细菌的丰度，强化产电硫氧化活性，促进硫化物氧化，从而加速黑臭河道沉积物修复。因此，我们选取了珠江三角洲河道污染相当严重的顺德容桂的河道作为主要研究对象，开展黑臭河道沉积物中电缆细菌的培养和功能活性研究，希望通过这项研究创新黑臭河道治理技术，加速河道生态系统的修复进程。

◎研究方法及过程

沉积物样品的采集和处理

实验所用的沉积物采自顺德容桂某典型电器工业聚集区的黑臭河道。将采集回来的河道沉积物过筛（0.35mm，45目），去掉树枝树叶类的杂质及大的颗粒物。其中一部分新鲜沉积物装入100mL烧杯中用于电缆细菌的富集培养，另一部分经冷冻千燥、研磨过筛（0.15mm，100目），-20C保存用于进一步分析沉积物中污染物的组成特征。将装有新鲜沉积物的100mL烧杯置于充满河水、水温维持在25土1C的池子中，使上覆水高10cm。分别采用曝气充氧和投加硝酸盐2种方式调节上覆水体中电子受体的浓度，在培养0、1、3、6、9、12、15、18、24、30和50天时测定沉积物的环境参数，并采集表层2cm的沉积物贮存于一80C，用于分析微生物菌群结构、酸挥发性硫化物（AVS）、硫酸根和总有机碳（TOC）的含量。

理化参数检测方法

沉积物的常规指标主要参考《水和废水监测分析方法（第四版）》进行测定。另外，还测定了沉积物中AVS含量。

微电极分析

采用微电极系统分析沉积物中O₂、pH值和H₂S随深度的变化特点。采用100%氧饱和水和溶解氧浓度为0的水作为2个校对点用于校对氧电极;pH值为4.00、6.86和9.18的标准缓冲溶液用于校对pH电极;H₂S电极则在暗室中采用无氧的HCI（32S=[H₂S]+[HS^-]+[S^2-]。

电缆细菌的扫描电镜（SEM）和荧光原位杂交（FISH）鉴定

选取培养了15天且具有明显产电硫氧化特征曲线的沉积物样品，挑取这些样品表层2cm的培养物，在盛有无菌水的白瓷盘中轻轻淘洗长度达lcm以上的长线状培养物，一部分置于细胞爬片上固定、脱水、风千用于SEM观察细胞形态;另一部分采用终浓度为50%（vol/vol）乙醇固定、-20C低温保藏用于FISH。分别采用Desulfobulbaceae的特异性荧光探针DSB706和核酸的常规荧光染料DAPI（4，6，-diamidino-2-phenylindole）对所获取的长线状培养物进行FISH，采用激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss）观察杂交结果。

电缆细菌16SrRNA基因克隆文库的构建与分析

构建16SrRNA基因全长克隆库，挑取阳性克隆子送样到上海生工进行测序。把得到的16SrRNA基因通过BLAST，与GenBank数据库中的DNA序列比对，记录同源性最高的细菌类型，并下载该细菌的16SrRNA基因。把下载的序列和拼接得到的样品序列用ClustalW软件进行比对，再将比对结果用MEGA7.0软件构建系统发育树，在iTOL（http：//itol.embl.de/）中展示所构建的系统发育树。

研究结果与讨论

黑臭河道沉积物中电缆细菌的培养

采集曝气充氧和投加硝酸盐2种培养体系富集培养了15天的表层2cm沉积物样品进行淘洗，均分离到大量长线状培养物。分别采用红色的Desulfobulbaceae特异性荧光探针DSB706和蓝色荧光探针DAPI对长线状培养物进行FISH分析，结果发现这些长线状细胞都可以被这2种探针同时杂交，经红蓝2种荧光叠加后，目标菌株在荧光显微镜下呈粉红颜色。采用SEM进一步观察这些长线状培养物的形态结构，发现所富集到的长线状微生物细胞直径约为0.8um，且沿着细胞长度可以观察到明显的脊状突起，这与国际上已报道的电缆细菌形状特征相当一致。

进一步在倒置显微镜下比较曝气充氧和投加硝酸盐2种培养体系中长线状培养物的丰度，结果发现曝气充氧组中培养物的平均丰度约为投加硝酸盐组的3倍。可见，曝气充氧这种培养方式更有利于电缆细菌的富集生长。

黑臭河道沉积物中电缆细菌的鉴定

为了了解黑臭河道沉积物中电缆细菌的种类及其系统分类地位，我们提取了淘洗获得的长线状培养物总DNA，分析这些长线状培养物的16SrRNA基因序列。结果发现，尽管这些培养物大约有14.58%仍然未能在科的水平被鉴定，但超过61.16%归属于Desulfobulbaceae科。进一步构建了这些培养物的全长16SrRNA基因克隆库，在GenBank中对这些基因序列进行比对分析，获得39个归属于Desulfobulbaceae的克隆子。通过分析比较这些序列与已报道电缆细菌的系统发育关系，发现这39个序列中除了编号为RG57的序列外，其他几乎都聚在同一个分支，而且与国际上已报道的分离自河流沉积物的电缆细菌F3（KP728463）的相似性介于93.04%～97.57%。编号为RG57的序列与国际已报道的分离自河流沉积物的电缆细菌F5（KP728465）的相似性最高，但仅为87.72%。由此可见，珠三角黑臭河道沉积物中的确存在电缆细菌，但与国际上已报道的电缆细菌相比，它们具有相对独立的系统分类地位。

黑臭河道沉积物中电缆细菌的产电硫氧化活性特点

结合倒置显微镜观察和微电极系统分析，跟踪监测曝气充氧培养电缆细菌过程中黑臭沉积物O2、pH值和H，S等指标随深度的变化特点。结果发现，在培养的前6天，体系中电缆细菌的丰度极低，每立方厘米的沉积物中仅能观察到3～5根电缆细菌，这时候微电极系统并不能检测到产电硫氧化曲线，沉积物中以基于扩散的氧化还原反应为主。培养至6～9天时，沉积物中电缆细菌的丰度提高了近千倍，这时微电极系统也检测到了典型的产电硫氧化曲线，电缆细菌以沉积物中的硫化物为电子供本、以上覆水体中的溶解氧为電子受体进行长距离电子传递。培养至第12～15天时，电缆细菌的丰度达到最高，此时体系种的pH值也达到最高（8.7），意味着这个时候电缆细菌所驱动的产电硫氧化过程氧化还原半反应最活跃。培养18天后，电缆细菌的丰度呈现下降趋势，产电硫氧化过程的氧化还原半版应也相应减弱，但是氧化半反应和还原半反应相隔越来越远。培养到第30天时，电缆细菌的丰度恢复到培养早期的水平，产电硫氧化过程的氧化还原半反应明显下降。而没有进行曝气充氧的对照组并没有观察到明显的变化。

进一步分析沉积物中硫元素的组成变化特点，发现经过4周的培养，曝气充氧处理组的沉积物中AVS的去除速率明显比对照组高，其含量由最初的（917.0土60.2）ug/g降低为（342.8土53.3）ug/g，而对照组中AVS的含量则仍高达（757.7土34.2）ug/g。与此同时，处理组孔隙水中硫酸根的含量也由最初的152.1mmol/L升高至1844.5mmol/L，明显高于对照组的394.4mmol/L。

这些研究结果充分表明，珠三角黑臭河道沉积物中的电缆细菌同样具有产电硫氧化活性。曝气充氧可以有效促进电缆细菌的生长，提高其产电硫氧化功能活性，使沉积物中的硫化物快速氧化为硫酸盐，从而缓解黑臭。

◎主要研究结论

◆本研究成功建立了从黑臭河道

沉积物中富集培养电缆细菌的方法，并获得了独特的、具有产电硫氧化功能的电缆细菌。

◆电缆细菌能将黑臭河道沉积物中的硫化物快速氧化为硫酸盐，有效缓解黑臭现象。

该项目获得第34届全国青少年科技创新大赛创新成果竞赛项目中学组环境科学与工程一等奖。

专家评语

本研究首次从黑臭河道底泥沉积物中培养出电缆细菌，探明了该细菌的独特分类地位及产电硫氧化特性，阐明了电缆细菌快速氧化硫化物缓解河道黑臭的机理。建议在本研究的基础上，进一步开展电缆细菌对黑臭河道的水质净化效能研究。

指导教师 许家裕 汪欣