第三代和第四代丙型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂在血站血液检测中的应用分析*

袁 婷，张 利△，彭 涛，杨俊龙，林 琴，叶森林，周 霞

(1.西部战区总医院输血科，四川成都 610083；2.四川省遂宁市中心血站，四川遂宁 629000；3.四川省眉山市中心血站，四川眉山 620010；4.成都医学院医学检验系，四川成都 610083)

世界卫生组织统计,全球丙型肝炎病毒(HCV)的感染率约为3%,感染者约有2亿人,每年新发丙型肝炎病例约3.5万例，其中50%～80%的感染者无明显症状并可进展为慢性感染,20%的感染者最终可进展为肝硬化甚至肝细胞癌[1]。我国1～59岁人群HCV感染率为0.43%，输血存在较高的感染风险[2]，阻断HCV传播对保障血液安全至关重要。目前国内大多采用第三代酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂检测丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)，虽然第三代试剂较第四代试剂价格低廉，但可能存在更高的假阳性率[3]或漏检率。本研究就两个不同厂家各自生产的第三代和第四代抗-HCV ELISA检测试剂在血站检测的阳性率、单试剂阳性率、灵敏度和假阳性率进行对比，为血站选择适合的抗-HCV ELISA试剂提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择某血站2016年3月至2019年3月采集的37 826例无偿献血者血液标本，将37 826例标本中采用厂家1第三代和厂家2第四代抗-HCV ELISA试剂检测结果为阳性的137例血浆标本于-40 ℃冻存。

1.2仪器与试剂 厂家1和厂家2提供的抗-HCV ELISA检测试剂(分别为厂家1第三代、厂家1第四代、厂家2第三代、厂家2第四代)，康彻斯坦标准物质，罗氏乙型肝炎病毒-丙型肝炎病毒-人类免疫缺陷病毒(1+2型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法，cobas TaqScreen MPX Test,version 2.0)。试剂均通过中国药品生物制品批批检验合格，并在有效期内。第三代抗-HCV ELISA检测试剂原理为间接ELISA法，第四代抗-HCV ELISA检测试剂原理为双抗原夹心ELISA法。主要仪器包括艾德康ELISA1100全自动酶免系统，罗氏cobas s201核酸检测系统，仪器均定期校准合格。

1.3方法 回顾性分析37 826例无偿献血者血样采用厂家1第三代和厂家2第四代抗-HCV ELISA试剂筛查抗-HCV的结果。将冻存的137例检测阳性的血浆标本，采用厂家1第四代和厂家2第三代抗-HCV ELISA试剂进行检测，并采用聚合酶链反应(PCR)定性检测HCV-RNA以进行确证，分别比较两个厂家第三代和第四代试剂的灵敏度和假阳性率。检测步骤均严格按试剂说明书进行。

1.4结果判定 ELISA：S代表标本的吸光度(A值)，cut off值=阴性对照孔平均A值+0.12，二者之比即为S/CO值,S/CO≥0.5为阳性,S/CO<0.5为阴性。双试剂阳性：两种试剂检测结果均为阳性；单试剂阳性：仅其中一种试剂检测结果为阳性，且用该试剂双孔复查结果仍为阳性。

1.5统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行统计处理和分析。计数资料以例数或率表示，组间结果的比较采用χ2检验。灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；假阳性率=假阳性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.137 826例献血者抗-HCV检测结果 厂家1第三代和厂家2第四代试剂双阳性率为0.12%(44/37 826)；总阳性数137例，总阳性率为0.36%(137/37 826)。其中厂家1第三代试剂阳性率为0.32%(122/37 826),厂家2第四代试剂阳性率为0.16%(59/37 826)，二者比较差异有统计学意义(χ2=21.981，P<0.05)。厂家1第三代试剂单阳性率为0.21%(78/37 826)，厂家2第四代试剂单阳性率为0.04%(15/37 826)，二者比较差异有统计学意义(χ2=42.730，P<0.05)。见表1。

表1 37 826例无偿献血者抗-HCV ELISA检测结果(n)

2.2137例冻存标本抗-HCV检测结果以及灵敏度、假阳性率比较 厂家1第三代试剂灵敏度为86.54%(45/52)，厂家1第四代试剂灵敏度为98.08%(51/52)，二者比较差异有统计学意义(χ2=4.875，P=0.027)。厂家1第三代试剂假阳性率为90.59%(77/85)，厂家1第四代试剂假阳性率为5.88%(5/85)，二者比较差异有统计学意义(χ2=122.129，P<0.05)。厂家2第三代试剂灵敏度为92.31%(48/52)，厂家2第四代试剂灵敏度为98.08%(51/52)，二者比较差异无统计学意义(χ2=1.891，P=0.169)。厂家2第三代试剂假阳性率为35.29%(30/85)，厂家2第四代试剂假阳性率为9.41%(8/85)，二者比较差异有统计学意义(χ2=16.404，P<0.05)。见表2～5。

表2 厂家1第三代试剂检测结果(n)

表3 厂家1第四代试剂检测结果(n)

表4 厂家2第三代试剂检测结果(n)

表5 厂家2第四代试剂检测结果(n)

3 讨 论

从2.1结果可以看出：厂家1第三代试剂阳性率为0.32%，厂家2第四代试剂阳性率为0.16%；厂家1第三代试剂单阳性率为0.21%，厂家2第四代试剂单阳性率为0.04%。厂家1第三代和厂家2第四代试剂的阳性率、试剂单阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，因此怀疑第三代试剂假阳性率过高。从表2～5可以发现，与同一厂家的第三代试剂比较，两个厂家第四代试剂的灵敏度更高、假阳性率更低。137例ELISA试剂检测阳性的献血者标本经PCR确认52例HCV-RNA阳性，85例为阴性。厂家1第三代试剂阳性122例，经过PCR确认45例HCV-RNA阳性，灵敏度为86.54%，假阳性率为90.59%。厂家1第四代试剂阳性56例，经过PCR确认51例HCV-RNA阳性，灵敏度为98.08%,假阳性率为5.88%。厂家1第三、四代试剂的灵敏度和假阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。厂家2第三代试剂阳性78例，经过PCR确认，48例HCV-RNA阳性,灵敏度为92.31%，假阳性率为35.29%。厂家2第四代试剂阳性59例，经过PCR确认，51例HCV-RNA阳性，灵敏度为98.08%,假阳性率为9.41%。厂家2第三、四代试剂灵敏度比较，差异无统计学意义(P>0.05)，二者假阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。137例标本经HCV-RNA确认，两个厂家第三、四代试剂均存在漏检情况：厂家1第三代试剂漏检7例，厂家2第三代试剂漏检4例，厂家1和厂家2第四代试剂均漏检1例。

血液为珍稀资源，抗-HCV阳性是成品血报废的主要原因之一[4]，相关标准要求献血者血液检验既要有较高的灵敏度保证血液安全，又要有较低的假阳性率以减少不必要的血液浪费。《血站操作技术规范》(2019版)规定：无偿献血者血液抗-HCV血清学检测方法包括ELISA法、化学发光免疫分析试验(CLIA)[5]。ELISA法是目前抗-HCV检测的主要方法，具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、可定量和半定量测定、检测成本低等优点[6]，缺点是容易产生假阳性结果，可能与下列因素有关：标本溶血、被细菌污染、贮存时间过长和标本凝固不全等标本处理问题；试剂盒的抗原不纯、采用多克隆抗体和酶结合物纯度低等试剂盒方面的问题；加样时间过长造成加样后放恒温箱前等待时间过长，加样后孔壁上贴有微小血块等问题；洗板针堵塞，抽吸不完全，洗液量不足，洗板次数少等问题[6-7]。

本研究中选用的两个厂家第三代抗-HCV ELISA检测试剂应用间接ELISA法检测免疫球蛋G(IgG)类抗-HCV，第四代试剂应用双抗原夹心ELISA法检测IgG类和免疫球蛋白M(IgM)类HCV总抗体。两个厂家第四代试剂较其第三代试剂有更高的灵敏度和更低的假阳性率的原因：(1)间接ELISA法虽是临床应用率较高的一种血清学抗-HCV检测方法，但第三代试剂只能检测血清中的IgG类抗体，对早期HCV感染存在一定漏检[8]，第四代试剂因其在第三代试剂检测IgG类抗体基础上增加了IgM类抗体的检测，能提高处于感染早期标本的检出率，缩短病毒感染检出的“窗口期”[9-10]；(2)间接法以酶标记的抗人IgG为二抗，血清中含量较高的IgG及类风湿因子等非特异性吸附易引起假阳性反应[8]；(3)双抗原夹心ELISA法用酶标记抗原，形成包被抗原-检测抗体-生物素抗原结构，对被检抗-HCV给予二次特异性反应，可有效避免间接法导致的假阳性现象[10]；(4)双抗原夹心ELISA法在试验的第一步加入生物素化的HCV抗原，对ELISA反应结果有放大效果，有利于提高试剂的最低检出限[9]；(5)加样的精确性直接影响后续的试验结果，从第三代试剂的加样量10 μL变为第四代试剂的50 μL，在相同的加样精密度条件下,10 μL的加样误差相比50 μL的加样误差更大[11-13]。

本研究显示，所使用的两个不同厂家第三代检测试剂灵敏度均低于第四代试剂，第三代试剂漏检风险更高，假阳性率也更高。血站采用两个不同厂家的抗-HCV ELISA试剂检测献血者抗-HCV,任意一种试剂呈阳性,血液便不能用于临床,导致血液报废，献血者也因此被列入献血黑名单，不能再次参与献血,这种策略虽有利于确保血液安全,但势必也会造成血液资源的浪费[14]和献血者流失[15]。《血站技术操作规程》(2019版)提出开展核酸检测同时只要求进行1次血清学检测，采用先血清学检测再对阴性标本进行核酸检测的检测策略。在该检测策略下，选择第四代抗-HCV ELISA试剂相较于第三代试剂，不仅灵敏度高，能更好地保障血液安全，而且假阳性少，可在一定程度上提高检出率，同时减少不必要的血液浪费，避免对献血者造成不必要的心理负担，减少献血者流失[15]。该检测策略亦能有效降低血清学阳性标本污染核酸实验室的风险，更好地促进血站血液检验及无偿献血工作的开展。