粪便SFRP2基因甲基化联合定量免疫便潜血检测在结直肠癌筛查的应用

康 倩, 谢 惠, 王 昕, 张 杰, 李 娜, 盛剑秋

(中国人民解放军总医院第七医学中心消化内科，北京 100700)

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率和死亡率逐年增加[1]。有效的筛查可降低结直肠癌发病率和死亡率[2]。粪便潜血检测操作简便，费用低，依从性高，被临床上广泛应用于早期结直肠癌的初筛,但存在诊断效能低和假阳性率高的问题[3]。粪便SFRP2基因甲基化是结直肠癌新的分子标志物[4]。本研究将传统的定量免疫便潜血联合粪便SFRP2基因甲基化检测给结直肠癌筛查提供新的思路，并取得较好的筛查效果，现报道如下：

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2018年01月至2018年12月在我中心消化科门诊行结肠镜检查和病理检查确诊的106例结直肠癌患者为研究对象，同时选取106例进展性腺瘤患者及106例健康人群，结直肠癌患者包括男65例，女41例，年龄45～78岁，平均年龄(68.01±6.58)岁；进展性腺瘤患者中男62例，女43例，年龄48～77岁，平均年龄(65.16±7.32)岁，健康人群中男63例，女42例，年龄47～80岁，平均年龄66.42±6.48岁，纳入标准：①无其它部位肿瘤；②首次确诊，无复发和转移；③未进行化疗。排除标准：①曾接受放化疗；②非原发癌灶者及不能确诊等其他情况；③肉眼见血性大便者。三组研究对象年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。三组人群粪便标本收集于无菌容器。标本于24h内保存于-80℃冰箱待测。本研究经中心伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2方 法

1.2.1粪便DNA提取，用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德国)从粪便标本(250 mg)分离DNA，-80 ℃保存备用。

1.2.2亚硫酸氢盐处理 用EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen，德国) 对基因组DNA 进行转化和纯化。

1.2.3甲基化特异性PCR 重亚硫酸盐修饰的DNA 作为模板,引物设计见表1，反应条件为：98 ℃ 10 s，非甲基化引物50 ℃退火30 s，甲基化引物62 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。在2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，然后在紫外光凝胶成像系统中观察结果。

表1 SFRP2引物序列

1.2.4定量免疫便潜血法检测：日本荣研化学株式会社生产的OC-SENSOR Micro自动粪便隐血检测仪及配套试剂、质控品、校准品。严格按操作规程执行，仪器自动生成打印检测结果，以血红蛋白浓度≥100 ng/mL 为阳性。

1.3统计分析:应用SPSS17.0 统计软件处理数据，计数资料采用χ2检验，P<0.05表示有统计学意义。

2 结 果

结直肠癌组、进展性腺瘤组粪便SFRP2基因甲基化阳性检出率均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，结直肠癌组高于进展性腺瘤组，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表2。结直肠癌组、进展性腺瘤组定量免疫便潜血阳性检出率均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，结直肠癌组高于进展性腺瘤组，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表3。结直肠癌组、进展性腺瘤组SFRP2甲基化联合定量免疫便潜血阳性检出率均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，结直肠癌组高于进展性腺瘤组，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表4。粪便中SFRP2基因甲基化，定量免疫便潜血以及联合检测的灵敏性分别为77.35%，83.96%和93.40%，特异性分别为93.40%，98.11%和93.40%。联合检测在不降低特异性情况下，灵敏性较单独检测显著增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组粪便SFRP2甲基化检出率

表3 各组定量免疫便潜血阳性检出率

表4 SFRP2甲基化联合定量免疫便潜血阳性检出率

3 讨 论

结直肠癌早期没有明显特征，大多在中晚期才被确诊，故早期筛查结直肠癌可明显提高治疗效果和延长生存时间[4]。肠镜联合病理检查在诊断结直肠癌中的灵敏性和特异性最高，但国内医疗资源相对缺乏，同时患者依从性较差，不适合用于大规模筛查。粪便潜血实验作为结直肠癌筛查重要手段，已在临床应用几十年。定量免疫便潜血法采用免疫比浊法，通过乳胶凝集光学检测技术自动检测对粪便中血红蛋白进行定量检测，检测精度高，线性范围宽,灵敏度高，但还存在一定的假阳性[5]。最近研究显示，表观遗传学在结直肠癌发生发展中发挥重要作用[6]。由于在粪便中能检测甲基化，分析粪便的异常甲基化可能为非侵袭性检测结直肠癌提供一种新的策略。因此本研究采用联合SFRP2基因甲基化作为筛查手段，提高筛查效率。

本研究结果显示结直肠癌组、进展性腺瘤组粪便SFRP2基因甲基化阳性检出率以及定量免疫便潜血阳性检出率均高于对照组(P<0.05)，而且结直肠癌组高于进展性腺瘤组(P<0.05)。SFRP2甲基化联合定量免疫便潜血联合检测用于结直肠癌组、进展性腺瘤组检出率明显高于对照组(P<0.05)，结直肠癌组高于进展性腺瘤组(P<0.05)。二者联合检测在不降低特异性情况下，灵敏性高于单独检测(P<0.05)。SFRP2基因甲基化而导致转录沉默,作为Wnt信号负调节剂诱导肿瘤细胞增殖分化，与结直肠癌密切相关[7]。本文结果说明在健康人群中SFRP2基因发生甲基化的比例极低，而在结直肠肿瘤中甲基化比例显著增加，在结直肠癌中比例最高，随着结直肠癌进展，甲基化状态改变越明显。联合检测筛查结直肠癌可能会提高筛查的准确性，可作为初步筛查结直肠癌的策略。综上所述，SFRP2甲基化联合定量免疫便潜血可以提高筛查结直肠癌准确性，可作为社区筛查结直肠癌常规手段，值得临床推广应用。