柱前衍生毛细管电泳-电致化学发光法测定日用化妆品中的氨甲环酸含量

王 荣, 周 敏, 王苏霞, 廖 原, 樊 雪, 马永钧

(西北师范大学化学化工学院, 甘肃省生物电化学与环境分析重点实验室, 甘肃 兰州 730070)

氨甲环酸(反式-4-氨甲基环己烷甲酸,tranexamic acid, TA),又名凝血酸、传明酸,是一种具有止血作用的化学合成药物,已被广泛应用于内科、外科及口腔科等临床医学领域[1-3],作为一种治疗牙龈出血症的有效药物成分也常被添加在牙膏配方中[4]。此外,人们还发现,氨甲环酸具有抑制黑色素斑形成、去除皮肤皱纹等美容效果[5,6],它也作为一种皮肤护理剂广泛添加在化妆品中。然而,长期使用含有此类药物的日化品很可能升高人体内形成血栓的风险并导致其他一些不良作用[7]。日化品中氨甲环酸的准确分析方法能对其过量添加行为进行更加严格的监管,也为保障此类日化品的长期安全使用提供数据信息[4,8-10]。

目前,可用于检测氨甲环酸含量的主要方法有高效液相色谱法[4,8,9,11-13]、液相色谱-质谱联用法[10,14-17]、紫外检测毛细管电泳法[18]、微芯片分离-化学发光联用法[19]、荧光法[20-22]和分光光度法[22-24]等。其中针对生物、化妆品之类具有复杂基底成分的试样,通常都会采用液相色谱法来进行常规分析[8,9,11,25]。由于氨甲环酸分子在紫外-可见光区的光吸收性能较弱且没有分子荧光特性,为提高液相色谱光检测器的检测灵敏度,氨甲环酸需先进行化学衍生反应后再进样分析[13];而为消除过量衍生试剂和衍生副反应产物的基底干扰引入的分散液/液微萃取操作环节,也必然导致样品分析的前处理过程变得比较繁琐、复杂[11]。毛细管电泳-电致化学发光(CE-ECL)联用法是一种高分离效率、高选择性、高灵敏度、低成本的分析新技术,业已用于临床医学、环境、食品等不同领域的实际样品检测[26]。基于我们此前报道的方法[27],本文采用甲醛为N-甲基化衍生试剂,可将氨甲环酸转化为具有强发光信号的衍生产物,用CE-ECL法实现了对复杂基底样品中氨甲环酸的分离、检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

MPI-A型多参数分析测试系统(西安瑞迈电子科技有限公司); CHI760B型电化学工作站(上海辰华仪器公司); F-320型荧光分光光度计(天津港东科技股份有限公司);熔融石英毛细管(50 cm×75 μm,河北永年光导纤维厂); pH-10型酸度计(德国赛多利斯有限公司)。化学发光信号检测采用三电极系统:工作电极采用含稀土类普鲁士蓝(Er-PBAs)修饰的铂盘电极(Φ=0.3 mm),修饰所用的试剂中仅将稀土离子Eu3+更换为Er3+后即可按原文献方法进行制备[44];辅助电极为铂丝;参比电极为Ag/AgCl (1.0 mol/L KCl盐桥)电极。

TA(含量>98.0%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);肌氨酸(Sar,含量>99.0%),六水合二氯联吡啶钌(含量>98.0%)和壳聚糖(脱乙酰度>95%)(百灵威科技有限公司);纳米羟基磷灰石(含量>99.9%,平均粒度约20 nm)(北京德科岛金科技有限公司); 1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体(ImidBF4IL,纯度>99%)(兰州中科凯特科工贸有限公司); D-(+)海藻糖二水合物(纯度>99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);其余试剂均为分析纯,实验用水均为超纯水(>18 MΩ·cm)。

1.2 实验条件

1.2.1电泳测定条件

MTS-gel的合成方法:在一只10 mL的比色管中加入10.0 mmol/L的硝酸镁1.00 mL、20.0 mmol/L的海藻糖溶液0.50 mL、20.0 mmol/L的硅酸钠溶液3.00 mL后用水定容,并置于32 ℃的水浴锅中保温反应13 min,取出后自然冷却至室温备用。此凝胶须用前临时制备,当它作为分离添加剂配制运行液时,MTS-gel凝胶就能转化为比较稳定的溶胶形式,因此配制好的运行缓冲液保存于冰箱中就可保证正常使用数天。

石英毛细管采用了壳聚糖/磷灰石纳米粒子做修饰内壁,具体修饰步骤参见文献[27],所有制备环节中仅将含10.0 mg/mL的壳聚糖稀冰醋酸溶液(1.0%, v/v)置换为含10.0 mg/mL壳聚糖+1.0 mg/mL纳米羟基磷灰石的稀冰醋酸溶液(1.0%, v/v),而保持其他制备条件完全一致,即可制备出符合分析要求的内壁涂饰毛细管。

1.2.2标准溶液和试样溶液的配制与衍生反应步骤

用标准品试剂分别配制1.00 mmol/L氨甲环酸溶液和1.00 mmol/L肌氨酸溶液储备液,置于4 ℃冰箱中保存备用。使用前按所需浓度准确吸取、用水稀释后配制成标准工作液。

称取1.000 g牙膏膏体样品于50 mL小烧杯中,先加入0.5 mL 10 mol/L的硝酸钙,搅拌并静置5 min后再加入0.5 mL 10 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=7.0),再搅拌后加入2.0 mL无水乙醇,搅拌均匀后全部转移至25 mL比色管中,以水定容,放置达到自然沉降分层,定量吸取上层清液备用。

面膜营养液样品可采用机械挤压法,直接提取适量体积的试样原液至100 mL小烧杯中,可不加硝酸钙和磷酸盐缓冲液,仅加2.0 mL无水乙醇和适量水搅拌,再全部转移至25 mL比色管中以水定容,备用。所有预处理后的待测溶液应先加适量内标物,并按适当倍数稀释定容,之后可用于下一步的衍生反应。

在一只10 mL比色管中先加入1.00 mL 0.25 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH=5.95),用移液管准确加入一定体积的混合标准溶液(含内标物)或待测样溶液(此刻加入溶液的总体积小于3.0 mL),再加入1.00 mL 0.5 mol/L的甲醛溶液,并用水稀释到5.0 mL刻度处,于室温下放置60 min;然后,在比色管中依次加入0.40 mL 0.20 mol/L的氢氧化钠和0.60 mL 0.01 mol/L的顺丁烯二酸溶液,摇匀后放入57 ℃恒温水浴中加热反应50 min,取出冷却至室温;再逐次加入0.25 mL 0.1 mol/L醋酸铵、1.0 mL 0.25 mol/L硼氢化钠(使用时现配)以及0.50 mL 0.2 mol/L的硼酸溶液,3种试剂的加入间隔时间分别为10、20和10 min。最后,以水定容至10.0 mL刻度处,取此溶液经由滤膜过滤后进样测定,也可于冰箱中保存,2周内测定。

2 结果与讨论

2.1 氨甲环酸与肌氨酸衍生产物的电致化学发光响应特性

未衍生的氨甲环酸与肌氨酸均为氨基酸类化合物,它们与联吡啶钌试剂产生的电致化学共发光信号非常弱,也就无法用柱端ECL方式直接检测出经毛细管电泳分离后这两种化合物的电泳峰。但依据我们此前的研究结论[27],将一些氨基酸分子的伯胺基或仲氨基通过N-甲基化衍生反应转化为叔氨基时,其电致化学发光效能会有极大地提高,因此我们采用CE-ECL法对氨甲环酸和肌氨酸的混合标准溶液进行了衍生反应前后的对比试验。如图1所示,a曲线为未经衍生的100 μmol/L氨甲环酸和25.0 μmol/L肌氨酸混合标准溶液的电泳图,通过加标试验证实只有242 s处的极弱电泳峰归属于未衍生的肌氨酸,其他位置的弱峰均为试剂中带入的杂质峰,同时说明进样100 μmol/L的氨甲环酸不会出现电泳峰。但如b曲线所示,进样氨甲环酸和肌氨酸的混合衍生产物后却能发现3个强电泳峰,经过加标试验可以确定:1号峰源于反应试剂甲醛的一种发光衍生产物,2、3号电泳峰则分别归属于氨甲环酸和肌氨酸各自的衍生产物。对比曲线a和b可以发现,衍生前后氨甲环酸分子由不出峰到形成了高达3 600(a.u.)的强发光信号峰,而在相同浓度水平上的肌氨酸分子衍生前后的发光峰也至少增敏了20余倍,并且均未产生属于其他衍生副产物的电泳峰。这表明用甲醛为N-甲基化衍生试剂时,经柱前衍生反应,氨甲环酸和肌氨酸各自都可以得到具有强ECL发光响应信号的单一衍生产物,而且它们发光峰的强度都与其衍生前的初始浓度有定量关系,因此肌氨酸适合被选定为测定氨甲环酸的内标物,而采用内标法对实际样品中的氨甲环酸进行定量测定,保证了本方法的准确度不再受柱前衍生反应条件波动带来的误差影响。

图 1 氨甲环酸与肌氨酸混合标准溶液经衍生反应(a)前、 (b)后的对比电泳图Fig. 1 Contrastive electropherograms of the mixed standard solution of tranexamic acid (TA) and sarcosine (Sar) (a) before and (b) after the derivatization reaction 1. unknown derivative form formaldehyde reagent; 2. TA derivative; 3. Sar derivative. TA: 100 μmol/L; Sar: 25.0 μmol/L.

2.2 背景电解质中分离添加剂的优化

图 3 具有不同硅酸根与镁离子组成比MTS-gel凝胶的 共振瑞利光散射光谱图Fig. 3 RRS spectra of MTS-gel with the different substance constituent ratio (R) of to Mg2+ A set of curves (a-f) shows influence of the MTS-gel concentrations on their RRS peak intensities when fixing a constant R value (R=6). Inset shows the variation of the slope (k) of linear fitting equations existed between RRS peak intensities of MTS-gel and its concentrations when modifying the R value (R=0-10). MTS-gel: a. 200 μmol/L; b. 250 μmol/L: c. 300 μmol/L; d. 350 μmol/L: e. 400 μmol/L; f. 450 μmol/L.

图 2 MTS-gel的加入量对氨甲环酸和肌氨酸发光衍生物 电泳分离度的影响Fig. 2 Effect of the added amount of Mg2+-trehalose- (MTS-gel) on the electrophoresis resolution between TA and Sar derivatives Δt: difference of the migration time of Sar and TA.

2.3 用共振光散射光谱法确定MTS-gel的化学组成

图 4 用内标法测定一系列不同浓度氨甲环酸标准样品的CE-ECL电泳图Fig. 4 Serial electrophoregrams of the standard solution samples with different TA concentrations for determination by internal standard method Sar: 25.0 μmol/L. TA: a. 25.0 μmol/L; b. 50.0 μmol/L; c. 100 μmol/L; d. 250 μmol/L; e. 500 μmol/L.

2.4 测定氨甲环酸的标准工作曲线

在优化的分析条件下,首先做了内标物肌氨酸的标准曲线,发现肌氨酸初始浓度(CSar, μmol/L)在25～400 μmol/L范围内与其衍生物电泳峰的强度(ISar)呈线性关系,回归方程为ISar=21.39+26.22CSar(相关系数r2=0.999 0)。肌氨酸的检出限为4.8 μmol/L(S/N=3)。再固定肌氨酸为25.0 μmol/L,仅改变氨甲环酸浓度,对这一系列混合标准液进行柱前衍生并纪录其CE-ECL电泳图。由图4可见,分别属于氨甲环酸和肌氨酸内标物的电泳峰的峰形均非常对称、半峰宽狭窄、分离度良好,因此可以通过直接测取两个电泳峰的峰高比为定量依据。实验测得氨甲环酸的初始浓度(CTA, μmol/L)与电泳图中两个衍生产物的发光峰高比值ITA/ISar之间在10～750 μmol/L的浓度范围内呈线性关系,回归方程为ITA/ISar=-0.510 3+0.022 6CTA(r2=0.999 3)。经计算得出检出限为3.6 μmol/L(S/N=3)。对比这些定量参数可知,本法略优于文献[18]报道的CE-UV测氨甲环酸方法。以含100 μmol/L氨甲环酸+25.0 μmol/L肌氨酸的混合标准溶液为试样,经衍生后反复平行进样测定8次,经统计得到氨甲环酸和肌氨酸峰高度值的标准偏差分别小于3.6%和2.3%,而相应电泳峰迁移时间的平均标准偏差值分别为3.6%和2.9%,表明本法测定结果的精密度良好。

2.5 实际样品测定

在优化的分析条件下,采用内标法对市购的3种牙膏和2种面膜中的氨甲环酸含量进行了测定,结果如表1所示。在实际样品中进行加标回收试验,回收率值介于92.5%～104.0%,表明本法的准确度较好。目前,国家市场监管部门还未对牙膏中氨甲环酸的添加量作强制性限定;中国台湾化妆品卫生管理条例中初步规定,化妆品中氨甲环酸的最高添加量限为2%～3%;中国香港地区则明确规定,氨甲环酸在牙膏中的限量为0.05%[4]。由表1数据可知,国内市场中这几种日化品中氨甲环酸的含量略有差异,但基本上均能符合安全要求。

表 1 实际样品中氨甲环酸含量的测定结果(n=3)

3 结论