保健食品中违禁药物检验技术研究进展

陈东洋, 张 昊, 冯家力, 曾栋

(湖南省疾病预防控制中心, 湖南 长沙 410005)

保健食品是具有特定保健功能,适用于特定人群食用的食品,具有调节人体功能的作用。当前,在我国保健食品的申报功能有减肥、辅助降血糖、缓解体力疲劳、增强免疫力、改善睡眠、辅助降血压和营养素补充剂等28项。随着生活水平的提高和老龄化社会的到来,消费者日益注重自身保健,对保健食品的消费也越来越大。但当前我国保健食品市场制售假冒伪劣产品、虚假夸大宣传保健品功效和欺诈式出售产品现象屡屡发生。尤其有生产企业受利益驱使,在保健食品中非法添加违禁药物,给消费者身体健康带来严重威胁,极大影响保健食品产业的可持续发展[1]。对保健食品中违禁药物进行有效监管,建立高效、可靠的保健食品中违禁药物检测方法已成为行业亟待解决的焦点问题。本文梳理了国内外保健食品中违禁药物的使用现状及检测方法研究进展,为保健食品安全评价技术发展方向提供参考。

1 保健食品违禁药物非法添加概况

目前在我国涉及增强免疫力、缓解体力疲劳、辅助降血压、辅助降血脂和减肥类保健食品非法添加现象最为突出[2]。孙鑫贵等[3]在国家卫生监督抽检中发现减肥、缓解体力疲劳和辅助降血脂类保健食品中违禁药物的总检出率达到14.5%,在24个阳性样品中,联合使用违禁药物的样品为11个,占比达45.8%。而随着消费人群的增大,其他类别如辅助改善记忆类、改善生长发育类、改善营养性贫血类、美容养颜类等保健食品也受到越来越多消费者的青睐,违禁药物非法添加也时有报道。这些情况引起了社会对保健食品中违禁药物的极大关注。将违禁药物非法添加纳入保健食品安全评价势在必行。为此,国家食品药品监督管理局制定了《保健食品中可能非法添加的物质名单(第一批)》,罗列了减肥、辅助降血糖、缓解体力疲劳、增强免疫力、改善睡眠和辅助降血压6类功能产品中可能非法添加的药物名称[4]。本文根据药效学特性和国家食药总局制定的名单将保健食品中可能非法添加的药物列于表1。

表 1 (续)

表 1 常见保健食品中可能非法添加的药物

另一方面,根据近年的保健食品产品监测情况及文献资料来看,保健食品违禁药物非法添加逐渐呈现新的特点:(1)保健食品非法添加的药物化学成分越来越复杂,主要包括处方药、已退市药物、现有药物结构类似物、尚未批准的新型药物和先导化合物等。尤其是新型药物和通过对现有药物结构进行微小修饰获得的结构类似物给非法添加的鉴定带来极大困难;(2)添加方式从过去单一组分大剂量加入转变为一类组分或多类组分小剂量复合添加。因此建立和完善多组分非法添加的检测方法已成行业的热点;(3)原料中带入的非法添加。很多产品使用的原料是从专门从事提取物生产的企业购买后直接用于保健食品的,对提取物的生产环境、加工工艺、质量标准尚缺乏控制规范,存在一定的安全隐患,对原料的质量亟待关注。但国内保健食品违禁药物非法添加的检测方法研制起步较晚,主要是对少数在监测范围内的药物进行方法建立,对新药物、药物结构类似物的定性定量仍较为薄弱。大部分检测方法直接借鉴药典、食品的方法,而保健食品基质复杂,干扰多,方法专属性强,这些已成为保健食品质量标准提高的阻碍。

2 保健食品中违禁药物分析技术

近年来,国内外研究者对保健食品中违禁药物的测定做了大量的研究。检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、毛细管电泳法(CE)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)等。其中色谱和质谱联用技术综合了色谱的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏性和能够提供化合物分子质量与结构信息的优势获得了越来越多的应用。而为了筛查新型药物、先导化合物和药物结构类似物等非法添加,结构分析设备如红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)、拉曼光谱、高分辨质谱(HRMS)等纷纷被引入用于新物质的鉴定,尤其是LC-HRMS技术获得越来越多的重视。HRMS能进行相对分子质量的精确测定,且能提供多级质谱碎片离子信息,通过精确质量数的检索匹配及多级特征碎片离子确证,为未知化合物的筛查提供可能。

2.1 减肥类保健食品

减肥类保健食品是非法添加较为严重的类别。早期添加的药物主要为食欲抑制剂[5]和泻药,本课题组[6]针对早期应用的紫外法和间接碘量法难以准确测定含复杂基质保健食品中痕量酚酞的不足,通过优化检测波长、显色液和pH,建立准确、灵敏的比色分析方法,并在市场抽查的20个减肥类保健食品中检出含有酚酞样品2个;Gilard等[7]通过LC、NMR、MS和IR技术从购自中国的减肥药中筛查出了罗卡西林。此外,辅助性治疗药如能量消耗剂、吸收阻滞剂、利尿剂、双胍类降糖药等也纷纷被检出[8]。本课题组[9,10]通过优化色谱条件和质谱条件,解析违禁药物的分子断裂方式,建立了灵敏、准确、抗干扰能力强的LC-MS/MS和GC-MS测定减肥类保健食品中西布曲明、芬氟拉明、马吲哚和酚酞等违禁药物,发现有样品存在混合加入违禁药物的情况;郭常川等[11]建立了筛查保健食品非法添加的15种减肥类药物的LC-Orbitrap HRMS法和TraceFinder筛查数据库。检测范围涉及利尿剂、中枢兴奋药、食欲抑制剂、泻药等药物,方法可实现自动、高精度定性定量。

为躲避监管,违禁药物添加剂量一般较低,对保健食品中违禁药物进行富集和纯化十分必要。马微等[12]针对泻药、能量消耗剂、吸收阻滞剂、利尿剂和双胍类共20种违禁药物建立了基质分散固相萃取-HPLC-MS/MS,样品用乙醇-丙酮(7∶3, v/v)超声提取,经N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷净化,以T3柱分离,采用LC-MS/MS测定,方法分析速度快,为减肥类保健食品违禁添加提供高通量分析平台。本课题组[13]通过C18小柱对保健食品中的马吲哚进行固相萃取,再进行GC-MS分析,方法表明经过固相萃取能有效去除杂质,建立的方法抗干扰能力强,检出限为0.02 mg/kg,回收率为94.2%～102%。Ki等[14]针对非法添加的痕量利尿剂,分别采用固相萃取法(亲水亲脂型(HLB)柱和混合型弱阴离子交换反相型(WAX)柱), QuEChERS法和pH控制-液液萃取法净化待测物,建立了减肥类保健食品中35种磺胺类药物的UPLC-Q-TOF-MS法。结果表明m/z77.965 0和79.981 2分别对应[SO2N]-和[SO2NH2]-,是磺胺类药物的常见离子,中性离子丢失碎片(HCl和SO2)也是该药物常见的特征,通过提取常见离子峰和中性丢失扫描可快速鉴别磺胺类药物;pH控制-液液萃取前处理能获得较高的回收率(80.1%～108%)和较低的基质效应,方法的检出限为0.04～11.18 ng/g。

为应对新药物、药物衍生物在减肥类保健食品中的添加,多种定性定量检测设备的联合使用已成为未来分析的趋势。Yun等[15]通过LC-UV在减肥类保健食品中发现与氯化西布曲明特征光谱类似的未知物,经HPLC-Q-TOF-MS确定该化合物分子式为C18H27Cl2N,进一步通过红外光谱仪和核磁共振仪设备进行结构解析鉴别出西布曲明新的类似物。

随着检测任务的急剧增加,快速和高通量检测技术逐渐受到检测行业的重视。Chai课题组[16]将薄层色谱和拉曼色谱联用对减肥类保健食品中4种麻黄碱类药物进行定性和定量测定,方法检出限为0.01 mg/mL。测定结果与HPLC-Q-TOF-MS的测定结果吻合。此方法为现场快速检测麻黄碱类非法添加提供可能。Song等[17]采用流动注射MS/MS快速筛查减肥类保健食品中西布曲明、N-去甲基西布曲明、双去甲基西布曲明和酚酞,方法检出限为0.3～0.6 ng/mL,回收率为92%～95%, 相对标准偏差(RSD)为7%～9%。通过此方法对70个保健食品样品进行筛查,发现11个样品含有违禁药物,经LC-MS/MS确证,除一个样品受基质干扰结果有偏差外,其他结果一致。Mai等[18]通过便携式毛细管电泳-非接触式电导检测法快速测定保健食品中4种安非他命类药物。样品经甲醇超声提取,稀释进样。在优化后的电泳条件下,4种待测物的检出为10～500 μg/kg。实际样品测定结果与GC-MS结果吻合,表明开发的方法能用于安非他命药物的现场检测。

2.2 缓解体力疲劳及增强免疫力类保健食品

缓解体力疲劳类及增强免疫力类保健食品违禁药物主要为西地那非、伐地那非等磷酸二酯酶-5抑制剂(PDE-5)[19], LC、GC-MS和LC-MS是其主要测定方法。林芳等[20]针对食药局颁布的《保健食品中可能非法添加的物质名单(第一批)》抗疲劳类及增强免疫力类保健食品中可能添加的药物建立UPLC测定方法,方法回收率为90.1%～106.5%, RSD为0.7%～4.9%,检出限为2～3 ng。方法通过药物的特征光谱确证,无需前处理,简便、快捷,可作为抗疲劳类及增强免疫力类保健食品中违禁药物的快速检测方法。Marriort等[21]采用GC-MS/MS测定保健食品中西地那非及其衍生物(二甲基西地那非、蒙莫西地那非、硫代西地那非、硫代甲基西地那非和硫代蒙莫西地那非)。比较了电子离子化和化学离子化两种电离方式对结果的影响,在多反应监测模式下11 min内完成了分离和测定6种PDE-5,方法无需衍生化,前处理简单快速。结果表明采用化学电离方式能获得较好的方法性能,方法检出限为0.03～1.5 mg/kg,回收率为83.4%～108.8%。季申等[22]采用UPLC-Q-TOF-MS定性筛查保健食品中102种西地那非及其相关功效成分,方法通过甲醇超声提取样品,采用ESI源,Q-TOF-MS作检测器,正离子模式检测,与标准物质保留时间、母离子和碎片离子精确相对分子质量、元素组成进行比对,准确定性,同时归纳了其中98种PDE-5质谱碎片裂解规律,为可疑物的鉴定提供了参考。PDE-5极易通过化学修饰改变部分官能团在不改变功能的前提下躲避监管,给准确测定带来很大困难[23]。目前已发现超过50种PDE-5[24],而且数目仍在增加,因此如何快速鉴定该类药物极为关键。2012年,Jankovics等[25]在监测保健食品中伐地那非时首次筛查出其衍生物羟基硫代伐地那非。在通过LC-UV-MS/MS进行测定时获得相邻两个色谱峰1和2。分别采用正离子和负离子模式扫描,测得1和2的相对分子质量分别为504和520,进一步进行碎片分析,1和2表现出类似的碎片离子,通过与伐地那非碎片进行比较,鉴定出1为羟基伐地那非,且推测2和1的区别仅为C=O键被C=S键取代,通过紫外光谱得知2相对1光谱出现红移,2含有发色基团,一定程度证实了推测。进一步通过1H和13C核磁共振进行分析,在13C谱中1和2在咪唑并三嗪位置出现较大的差别,可证实为C=O键被C=S取代,这些同样在HRMS和红外光谱中得到证实,因此2可确认为羟基硫代伐地那非。同样,Shin等[26]和Kim等[27]采用NMR和TOF-MS鉴别出了西地那非和他达那非的亚甲基衍生物蒙莫西地那非和蒙莫他达那非。这些结果为违禁药物衍生物的鉴别提供了有益参考。

针对PDE-5衍生物多为未知物,很难购得相应标准品,易造成漏检、未检出等假阴性结果的困境,采用LC-HRMS检验技术,通过建立谱库,进行精确质量数的检索匹配及多级特征碎片离子确证,进行无靶向筛查,可以节约大量的标准品。Damiano等[28]建立了UPLC-TOF-MS法测定保健食品中他达那非、伐地那非和西地那非,方法检出限低至0.001 μg/mL,回收率为87.6%～105.7%, RSD为1.5%～13.2%,并在无对照品的情况下用TOF-MS法在样品中成功鉴定出西地那非硫代和硫代二甲基衍生物;王美玲等[29]利用HPLC-离子阱飞行时间质谱仪建立了保健食品中28种PDE-5测定方法,筛查检出限为0.2～7.0 μg/L,回收率为31.0%～114.0%, RSD为2.5%～14.9%,通过谱库检索、分子式预测及多级碎片离子质谱图鉴定,在不使用标准品的情况下能获得准确筛查结果。

2.3 改善睡眠类保健食品

随着生活节奏的加快,生活压力的增大,越来越多的人受到失眠的困扰,因此改善睡眠类的保健食品亦是非法添加的主要目标之一。苯二氮卓类、巴比妥类等精神药物具有镇定催眠,安神抗焦虑的作用,常被非法添加至镇静安神的保健食品中。严爱花等[30]建立了保健食品中22种苯二氮卓类药物同时测定的LC-MS/MS,通过内标法定量消除干扰物对离子化的影响,方法检出限为0.008 5～0.062 μg/L,回收率为58.0%～116.5%, RSD为2.4%～12.2%。潘小红等[31]通过系统比较不同的色谱柱、流动相的种类及比例,获得最佳的色谱条件,同时优化质谱参数对22种改善睡眠类违禁药物进行分析,利用TOF-MS给出待测物的精确相对分子质量,有效排除假阳性结果。

此外,同一类药物往往具有相同的主核单元,因此通过解析其裂解规律,获得通用碎片离子,可快速筛查违禁药物。卢丽等[32]和董喆等[33]通过LC-离子阱质谱法解析苯二氮卓类、巴比妥类等镇静剂质谱裂解规律,建立二级质谱图谱库,实现对违禁药物的快速定性筛查。Baek等[34]通过LC-ESI-TOF-MS鉴定保健食品中21种不同类型H1-抗组胺药物(烃胺类、吩噻嗪类、哌嗪类等),阐述其碰撞诱导解离路径,21种H1-抗组胺药物解离方式基本一致,为H1-抗组胺药物快速鉴定提供理论支持。

另一方面,现场快检技术亦逐渐引起关注,李静辉等[35]通过薄层色谱分离,拉曼光谱组分鉴别,快速筛查改善睡眠类保健食品中的三唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮和奥沙西泮。方法抗干扰能力强,基质对待测物几乎没有干扰,4种化合物的检出限为1～4 μg;叶雅真等[36]采用电喷雾-离子迁移谱快速筛查保健食品中的地西泮、咪达唑仑、硝西泮、阿普唑仑和巴比妥5种镇定安神类药物,采用基质匹配标准曲线法排除保健食品复杂基质带来的干扰,方法检出限为0.20～8.0 mg/L,回收率为78.7%～113.8%, RSD小于10%。这些方法为镇静催眠违禁药物的现场快速鉴定提供了技术支持。

2.4 辅助降“三高”类保健食品

高血压、高血脂和高血糖为我国高发慢性疾病,易引发心脑血管疾病,严重危害患者健康,因此辅助降“三高”类保健食品深受消费者的青睐。

根据药效学特性及已筛查出的非法添加,目前辅助降血压类保健食品存在的违禁药物主要包括:利尿剂如吲达帕胺、氢氯噻嗪等;钙拮抗剂如硝苯地平、尼莫地平等;肾上腺素受体阻断剂如阿替洛尔、美托洛尔等;血管扩充药和血管紧张素转化酶抑制剂等。孙夏荣等[37]建立HPLC-MS/MS测定保健食品中20种降压类药物,在30批保健食品中测出5批含有比索洛尔、氨氯地平、尼群地平和氢氯噻嗪。丁宝月等[38]通过UPLC-MS/MS快速测定降压类保健食品中34种化学药物。在5批辅助降血压类保健食品中检出4批添加了化学药物,包括卡托普利、尼群地平、苯磺酸氨氯地平、氢氯噻嗪、马来酸依那普利和硝苯地平。而辅助降血糖保健食品中常见违禁药物主要包括磺脲类、格列奈类、双胍类和噻唑烷二酮类,其中格列苯脲最为常见,其次为盐酸二甲双胍和盐酸苯乙双胍,其他如格列美脲、格列齐特和罗格列酮也偶有报道[39]。吴杨等[40]和Fu等[41]在保健食品中均检出格列苯脲。而在降血脂保健食品方面,他汀类药物是目前最有效的降血脂药物,是辅助降血脂类保健食品非法添加的首选。2018年,在《国家食品安全监督抽检实施细则》中将烟酸、洛伐他汀、辛伐他汀列入日常监督抽检项目。同年,全国食品保健食品欺诈和虚假宣传整治工作领导小组办公室将美伐他汀、洛伐他汀羟酸钠盐、去羟基洛伐他汀作为辅助降血脂食品抽检风险检测项目。姜树银等[42]将Q-Orbitrap高分辨质谱法应用于保健食品中烟酸、洛伐他汀和辛伐他汀的筛查、确证和定量,通过建立的方法在38批样品中检出2批阳性样品,非法添加均为洛伐他汀。李晓蕾等[43]检测了20批保健食品,发现主要添加的药物为烟酸和洛伐他汀。

综上,测定辅助降“三高”类保健食品中违禁药物的方法主要有LC和LC-MS/MS,尤其LC-HRMS在违禁药物筛查方面的应用越来越广,一般采用一级质谱快速筛查,二级和多级质谱确证,从而对目标物定性定量分析;同时,通过解析待测物的裂解规律为含有同类母核的结构改性物的初筛提供参考依据。现将测定辅助降“三高”类保健食品中违禁药物的典型检测技术总结见表2。

2.5 美容养颜类保健食品

在美白、祛痤疮、祛黄褐斑、抗皱等功能保健食品中,激素的非法添加最为人关注[53]。激素目前大体可分为4类:糖皮质激素、孕激素、雄激素和雌激素。糖皮质激素有消炎和免疫抑制作用,可快速消除炎症及某些感染类疾病的治疗,HPLC-MS是其主要测定手段。陈丽波课题组[54]建立了UPLC-MS/MS测定保健食品中非法添加的38种糖皮质激素。采用电喷雾正离子扫描方式,多反应监测模式测定,通过分子离子峰、二级碎片离子峰和保留时间定性,外标法定量。方法前处理简单(直接超声提取),灵敏度高(方法检出限为0.3～1.6 μg/L)。通过优化色谱、质谱条件实现了糖皮质激素药物的快速筛查和定量检测。Mu等[55]建立了SPE-UPLC-MS/MS测定抗皱美白类保健食品中30种激素。样品经乙酸乙腈溶液或丙酮水溶液提取后,经ENVI-Carb/NH2净化,UPLC-MS/MS测定;同时为了降低基质干扰,采用基质匹配工作曲线。该法具有较高的灵敏度(0.03～2 μg/kg)和回收率(74.7%～124.1%)。张亚峰等[56]采用HLB固相萃取柱净化样品,通过大气压化学电离-三重四极杆质谱测定保健食品中14种性激素药物,方法检出限为0.099 0～2.09 μg/kg,加标回收率为65.8%～118.8%。

2.6 其他方面

目前,联合用药降低单一药物含量以躲避监测是保健食品非法添加的发展趋势,因此建立多类别组分同时测定的方法是十分重要的。Kang等[57]使用基层较常配备的UPLC测定保健食品中20种抗痛风及骨质疏松药物,方法检出限为0.12～1.50 μg/mL,回收率为84.2%～106.6%,RSD≤2.92%,经HPLC-Q-TOF确证阳性样品,结果吻合,为基层实验室测定以上药物提供了技术参考。Carvalho课题组[58]采用毛细管区带电泳分离,非接触电导检测器和紫外检测器联用测定减肥类和缓解体力类保健食品中利尿剂、减食欲药物、泻药和抗抑郁药共11种化合物。有效解决了某些化合物无紫外发色基团的局限,同时避免采用昂贵的质谱设备。11种待测物非接触电导检测器的检出限为2.03～3.30 mg/L,紫外检测器的检出限为4.80～13.20 mg/L。李优等[59]采用QuEChERS法净化,LC-MS/MS法同时测定保健食品中减肥、安眠、降血糖、降血压、消炎止痛和抗疲劳类药物,通过优化QuEChERS净化剂组合及采用基质匹配标准溶液校正,有效去除基质干扰及消除离子抑制,方法检出限为0.010～1 mg/kg,回收率为63.1～115.7%。Oh等[60]对保健食品中156种非法添加(包括58种性功能障碍药物、49种类固醇、26种合成类固醇和23种抗组胺药物)进行了快速定性定量分析,针对普通质谱在超多组分、同分异构体、化学衍生物分离和辨别的不足,采用了UPLC-Q-TOF-MS通过提取共同离子色谱进行定性,内标法定量。方法检出限为0.02～16.04 ng/mL, RSD为0.16%～13.50%,回收率为81.6%～124.7%。

在检测技术上,随着检测仪器的发展,一些新技术也在保健食品检测中得以应用。如离子迁移谱,其不需要真空系统,且灵敏度很高,在小型化和微型化方面具有独特之处,可以用于现场在线分析。Jiang等[61]采用离子迁移谱与电喷雾离子化方法快速检测抗风湿保健品中非甾体类抗炎药物。待测物在3 min内完成测定,样品经甲醇提取、过膜后进样分析,无需前处理,方法灵敏(检出限低至0.06～0.33 μg/L)、稳定(RSD为0.9～3.3%),能应用于现场快速鉴定对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸钠和茚甲新5种抗炎性药物。

除了非法添加外,保健食品原料的安全性也值得关注[62]。保健食品的原料来源广,植物性、动物性及矿物质等皆可用于保健食品,而且目前缺乏严格的质量标准,亦为保健食品安全添加了诸多风险。如螺旋藻类保健食品中微囊藻毒素的存在[63],以中药等为原料的保健食品中抗生素的添加[64,65],原料可能存在的农药残留、兽药残留等。此外,保健食品接触材料的安全也需要行业的关注,主要为不合格材料的应用如不合格胶囊壳及生产企业将添加剂、药物添加至胶囊中以躲避监测或包装材料有害物质迁移等。

3 结论与展望

保健食品安全是制约保健食品行业可持续发展的核心因素,其中违禁药物非法添加是消费者关注的焦点。近年来保健食品违禁药物非法添加呈现出新的特点给检测技术提出更高的要求。但当前国内对保健食品违禁药物检测方法的研制主要集中在消费较广的减肥、增强免疫力、降血压、降血糖、改善睡眠等类别上,其他功能保健食品的研究仍较为薄弱。随着消费人群的增加,其他功能保健食品非法添加的检测技术需及时跟进。其次,目前方法检测项目范围较窄,专属性不够,尤其是非靶向新药物或药物结构类似物的定性筛查技术仍有待增强。传统的LC、LC-MS和GC-MS难以满足新物质鉴定要求,需要NMR、IR、HRMS等结构鉴别能力强的设备联合应用。这些都已成为保健食品质量标准提高的阻碍。

因此,保健食品非法添加的检测未来研究可能在以下几个方面展开:(1)加强目前研究较为薄弱的其他类别保健食品违禁药物的检验技术能力,增加检验指标和检验技术储备。如近期报道的辅助改善记忆类的“聪明药”、改善营养性贫血类、改善皮肤类等保健食品的非法添加。(2)提高保健食品原料质量控制检测技术能力。以中药及其提取物为原料是我国保健食品的特色,其可能存在的非法添加及农药残留等的监测是亟待解决的问题;接触材料、辅料的安全,食品和药用两用保健食品的兽药残留,甚至是抗生素的残留都值得关注。(3)未知物的鉴定。包括新药、药物结构改性物的鉴别。采用多分析设备的联合使用,引入IR、NMR等解析化合物结构的仪器有助于新的非法添加物的发现,尤其LC-HRMS在添加药物衍生物、未知药物的鉴定上将有越来越重要的应用。