硫酸亚铁法和Fontana法显示黑色素的比较研究

张冰娜，张丹桂，叶丹彦，洪楚珠，杨旅军

（汕头大学医学院第二附属医院转化医学研究中心，广东 汕头 515041）

在常规的病理切片或者在其他切片的检查中，显微镜下可见到细胞内或细胞间隙中所出现的带有颜色的颗粒，这些带有颜色的颗粒，不管是机体产生的，还是从体外进入组织的，都被称为色素。色素的存在影响切片的观看和诊断、切片的美观及图片的拍摄效果。有些色素应用特殊的方法显示出来后有助于疾病的诊断。

黑色素属于内源性色素中非血源性色素的一种，镜下可见该色素为淡黄色、金黄色或深褐色的颗粒，大小不等、形状不一，比较均匀地分布于细胞胞浆之内或胞质的边缘。黑色素细胞含有合成黑色素所必需的酪氨酸，络氨酸将黑色素原生物质氧化成黑色素。人体中的黑色素主要存在于皮肤的基底细胞中[1]。利用多巴氧化酶法、硫酸亚铁法和Fontana法可对黑色素细胞进行染色。其中多巴氧化酶法要求采取新鲜组织或组织固定于5%甲醛液且固定时间不能超过3 h，由此制成冰冻切片。对于常规包埋的石蜡切片，目前对黑色素细胞进行染色使用最多的方法是硫酸亚铁法和Fontana法，本研究比较这两种染色法对皮肤黑色素颗粒的染色效果。

1 材料与方法

1.1 动物造模

取6只体重350 g左右的黄棕色豚鼠，分成2组：3只正常组，3只处理组。在处理组的豚鼠背部剃出10个1.6 cm×1.6 cm大小的区域，使用360 mJ/cm2的中波红斑效应紫外线(ultraviolet radiation B，UVB)照射2周，观察色素沉着情况[2]。

1.2 组织包埋

分别取下正常组和处理组的豚鼠皮肤，4%多聚甲醛固定24 h，组织块冲水24 h，70%酒精浸泡24 h，80%酒精浸泡12 h，90%酒精浸泡12h，95%酒精Ⅰ浸泡2 h，95%酒精Ⅱ浸泡2 h，100%酒精Ⅰ浸泡1 h，100%酒精Ⅱ浸泡1 h，二甲苯Ⅰ浸泡30 min，二甲苯Ⅱ浸泡30 min，软蜡浸泡1 h，硬蜡浸泡2～3 h。

1.3 黑色素染色方法

1.3.1 硫酸亚铁法 配制试剂：(1)2.5%硫酸亚铁溶液；(2)用铁氰化钾1 g，蒸馏水99 mL，冰醋酸1mL配制铁氰化钾醋酸溶液；(3)1%醋酸溶液。操作步骤：切片脱蜡水化；2.5%硫酸亚铁溶液处理切片60～90 min或用隔水浴30 min；蒸馏水洗数次，约5 min；铁氰化钾醋酸溶液处理切片30～40 min或用隔水浴15 min；1%醋酸溶液分化切片10～20 s；VG复染1 min；95%酒精分化；脱水、透明并封片。

1.3.2 Fontana法 配制试剂：(1)配制氨银溶液，取10%硝酸银溶液20 mL，逐滴加入浓氨水，形成沉淀，继续加入浓氨水，至初形成的沉淀物被溶解为止。如果加入的浓氨水过多，必须逐滴地加入10%硝酸银溶液，直至溶液出现微浑浊。该溶液必须在加入20 mL蒸馏水，过滤后才可使用。将该溶液保存于4℃冰箱内，大约可使用1个多月；(2)0.1%氯化金溶液；(3)5%硫代硫酸钠溶液。操作步骤：切片脱蜡水化，蒸馏水洗数次；浸入氨银溶液于暗处浸染12～24 h；蒸馏水洗数次；0.1%氯化金水溶液调色5 min；蒸馏水洗数次；5%硫代硫酸钠水溶液定色5 min；流水冲洗5 min；伊红复染2 min；脱水、透明并封片。

2 结果

2.1 造模结果

正常组的豚鼠皮肤比较薄(图1A)，UVB照射2周后的豚鼠皮肤表皮呈轻中度增厚(图1B)。肉眼可见，紫外线照射早期，皮肤出现红点，后期颜色逐渐加深，并出现皮肤老化症状。

图1 正常豚鼠与UVB照射后豚鼠皮肤(HE染色，×200)

2.2 黑色素染色结果对比

分别用硫酸亚铁法与Fontana法对正常组豚鼠皮肤(图2A、B)和UVB照射组皮肤(图3A、B)进行染色，结果显示UVB照射组皮肤含黑色素颗粒的细胞数比正常组明显增多。硫酸亚铁法(图3A)中，黑色素显示绿至墨绿色；Fontana法(图3B)中，黑色素、亲银颗粒和嗜铬颗粒均显示黑色。

3 讨论

本研究表明硫酸亚铁法与Fontana法均能对豚鼠皮肤黑色素进行着色，显示照射UVB的豚鼠皮肤含黑色素颗粒的细胞数比正常豚鼠皮肤的明显增多。Fontana法是利用黑色素将氨银溶液还原成金属银的反应原理来显示黑色素[3]。Perls氏溶液临用前需新鲜配制，不宜久存。染色过程中，应避免用生锈及其他可能造成贴纸的普通水洗，而应用蒸馏水洗，防止氯银渣污染玻片，影响观察。切片在氨银溶液中浸染时，要在镜下观察以控制最佳染色时间，避免染色时间久，把脂褐素和橙色血质染成黑色。Fontana法显示黑色素颗粒为黑色，但也使亲银颗粒和嗜铬颗粒均显示为黑色。所以银染阳性的细胞只能说明含有黑色素，而不能证明就是黑色素细胞。另外此法作用时间长。与Fontana法对比，硫酸亚铁法的染色特异性较强，结果可靠，操作简便，时间短。硫酸亚铁法染色过程水浴温度和时间较难控制[4]。所用的试剂必须新鲜配制，否则不能获得理想的结果[5]。

图2 检测正常豚鼠皮肤黑色素(×400)

图3 检测UVB照射2周后豚鼠皮肤黑色素(×400)

综上所述，硫酸亚铁法对皮肤黑色素颗粒染色的特异性较强，操作简便，比较适合于临床病理检查及实验室研究。当然随着免疫组织化学方法的广泛开展，现在应用组织化学方法检测黑色素已经较少用[6]。