不同发酵剂制得的发酵牛肉调味基料的抑菌性研究

吴晨燕，杨 梅，梁丽雅，马俪珍,*

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；2.天津市强源食品有限公司，天津 301700）

传统牛肉调味料以牛骨肉末为原料，经高压浸提、酶解、美拉德反应制成，是天然热反应肉味香精的一种[1]。发酵牛肉调味料（Fermented Beef Flavorings,FBF）以传统制作工艺为基础，在酶解和美拉德反应中间增加发酵环节制作而成[2]，发酵处理能提高牛肉调味料的风味[3]，且终产物有很好的抑菌性[4]。发酵时间和发酵剂种类的差异会影响终产物的形成。马艺荧等[5]研究东北酸菜发酵时间对有机酸含量影响时发现，随着发酵时间延长，有机酸含量明显增加。王赫等[6]在研究发酵时间对乳酸菌发酵饲料中的主要营养物质含量影响时发现，发酵时间与饲料中的粗蛋白、氨基酸、蛋氨酸、乳酸菌活菌数、乳酸含量等均呈二次曲线关系，适宜的发酵时间会促进饲料中营养物质、乳酸菌、乳酸量的增加。陈忠军等[7]研究乳杆菌产细菌素的发酵条件时发现，乳杆菌在发酵24 h 时抑菌活性最强，随着发酵时间的延长抑菌活性下降[8]。不同发酵剂抑菌活性存在很大差异。有研究表明，植物乳杆菌、戊糖片球菌对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有较强的抑制效果，木糖葡萄球菌对上述四株致病菌的抑制作用较弱[9]。

课题组前期研究了15 种发酵剂发酵16 h 制备的FBF 的抑菌性差异，并筛选得到了抑菌效果较好的3 种发酵剂[4]，分别是WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳杆菌）、VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳杆菌）和清酒乳杆菌（Lactobacillus sake,LS）。为缩短FBF 的生产周期，试验将发酵时间缩短至12 h，考察发酵12 h 和16 h 制得的FBF 之间的抑菌效果差异。试验以WBL-45、VHI-41、LS 为研究对象，以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium, S.typhimurium）、大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphiB,S. para-typhiB）为指示菌。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

牛骨肉末（骨肉比 3∶7）、木糖、葡萄糖、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、维生素B1，顶兴（天津）食品科技发展有限公司产品；WBL-45、VHI-41，意大利萨科公司产品；LS，萨科商业复合菌中分离纯化获得；纯牛奶，内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司生产；MRS 液体培养基，北京索莱宝科技有限公司产品；风味蛋白酶、复合蛋白酶，丹麦诺维信公司产品；酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠，天津市风船化学试剂科技有限公司产品。

S.aureus（ATCC6538）、S.typhimurium（ATCC14028）、S.paratyphiB（ATCC50094）、E.coli，中国农业大学微生物实验室提供。

1.1.2 仪器与设备

SX-500 型高压蒸汽灭菌锅，Friocell 22 型恒温恒湿培养箱，3001-1339 VarioskanFlash 酶标仪，Bluepand恒温摇床。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化及菌悬液的制备方法

WBL-45 和VHI-41 两株商业复合发酵剂，使用前用灭菌纯牛奶活化2 h。LS 发酵剂于MRS 液体培养基37 ℃连续活化3 代，于4 ℃贮藏备用。

S.aureus、S.typhimurium、E.coli、S.paratyphiB 接种于LB 液体培养基并置于37 ℃恒温摇床中活化3代，于4 ℃贮藏备用。

1.2.2 FBF 的制备方法

1.2.2.1 工艺流程

原料选择（冷冻牛骨肉末）→高压浸提→酶解→发酵（或不发酵）→美拉德反应→离心

1.2.2.2 操作要点

（1）高压浸提：将60 g 牛骨肉末与240 g 蒸馏水混合均匀，0.1 MPa、121 ℃下加热 4 h。

（2）双酶同步酶解：浸提液冷却至室温，分别添加质量分数0.06%的风味蛋白酶和0.03%的复合蛋白酶，于50 ℃振荡4.5 h，酶解结束后沸水浴灭酶20 min。

（3）发酵：将 WBL-45、VHI-41、LS 分别接种至酶解液中，30 ℃下分别发酵12 h 和16 h，发酵结束后沸水浴灭菌20 min。商业复合发酵剂依照产品推荐量添加，添加量为牛骨酶解液质量的0.02%，单菌接种量为106CFU/mL。

（4）美拉德反应：每组在发酵液中添加1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸、1.8%维生素B1，搅拌均匀后在110 ℃下美拉德反应60 min。

（5）离心：所有处理组4 ℃冷藏过夜，两层纱布过滤去除牛油和骨渣，在2 ℃、5 000 r/min 条件下离心1 min，上清液4 ℃冷藏备用。

1.2.3 试验方案设计

参照FBF 的制备工艺，只在发酵环节设计不同处理。试验设计：①CK 组：不发酵；②发酵12 h：分别接种 WBL-45、VHI-41、LS 发酵剂发酵 12 h；③发酵16 h：在②的基础上将发酵时间延长至16 h。通过测定 FBF 作用于E.coli、S.typhimurium、S.paratyphiB、S.aureus等指示菌的OD600nm，确定其抑菌性。

1.2.4 FBF 制备过程中pH 的测定

分别在高压浸提、酶解、发酵、美拉德反应等环节结束后，取样测定pH。

1.2.5 抑菌率的测定

指示菌于37 ℃，130 r/min 活化12 h，用无菌LB将其稀释至浓度约为107CFU/mL。吸取FBF 10 μL 与90 μL 指示菌悬液进行混合。37 ℃反应12 h，测定600 nm 下的 OD指示菌+FBF值。同时进行空白对照和阳性对照，分别测定 600 nm 下的 ODLB、OD指示菌、ODLB+FBF。计算公式如下：

式中：ODLB为 100 μL LB 液体培养基在 600 nm 下的OD 值；OD指示菌为 100 μL 指示菌在 600 nm 下的 OD值；ODLB+FBF为 90 μL LB+10 μL FBF 在 600 nm 下的OD 值；OD指示菌+FBF为 90 μL 指示菌液+10 μL FBF 在600 nm 下的 OD 值。

1.2.6 数据处理

使用Excel 2016 处理数据，使用Sigma plot 10.0绘图，用Statistix8.1 中Tukey HSD 进行显著性检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 FBF 制备过程中pH 的变化

FBF 制备过程中pH 变化如图1 所示。随着各工艺环节的进行，各处理组pH 呈整体下降趋势。发酵结束后，12 h 组和16 h 组FBF 的pH 变化规律均表现为 WBL-45＞LS＞VHI-41（P＜0.05），说明 VHI-41发酵剂在3 株发酵剂中产酸能力最强。观察美拉德反应结束 pH 的变化，发酵 12 h 组（4.43～4.55）和 16 h组 FBF（4.28～4.48）显著低于 CK 组（4.73）。对比 12 h组和16 h 组FBF 的pH 差异，发酵16 h＜发酵12 h，说明发酵处理能显著降低FBF 的pH，随着发酵时间的延长，FBF 的pH 降低更加显著。其中VHI-41 发酵剂在3 株发酵剂中产酸能力最强，发酵12 h 和16 h的pH 均保持最低水平，其成品pH 分别为4.43 和4.28。

2.2 不同处理组对E.coli 抑菌率的影响

由图2 可以看出，CK 组和发酵组对E.coli均呈现较好的抑制效果。CK 组对E.coli的抑菌率为60%，发酵组对E.coli的抑菌率为76%～86%，二者间差异显著（P＜0.05）。3 种发酵剂中，VHI-41 组的抑菌效果最佳，发酵16 h 其抑菌率高达86%，与其他处理组差异显著（P＜0.05）；发酵12 h 抑菌率为83%，与WBL-45 发酵12 h 组无显著性差异。抑菌性最低的是LS组（发酵12 h 和16 h 其抑菌率分别为76%和79%）。发酵时间对抑菌率的影响因菌种不同而存在差异，VHI-41 发酵剂随着发酵时间延长对E. coli的抑菌性显著增加（P＜0.05），而其他2 种发酵剂随发酵时间延长抑菌性变化不显著。由此说明，VHI-41 组发酵16 h 制得的FBF 对E.coli的抑菌效果最好。

2.3 不同处理组对S.typhimurium 抑菌率的影响

由图 3 可以看出，CK 组对S. typhimurium的抑制率仅达到4%，发酵后FBF 抑菌性显著增强（P＜0.05），不同发酵剂对S. typhimurium的抑菌能力依次为：VHI-41＞LS＞WBL-45。发酵 12 h 组，VHI-41、LS、WBL-45 组FBF 抑菌率分别为 66%、58%、46%。发酵时间由12 h 延长至16 h 时，所有发酵组的抑菌率均显著提高（P＜0.05），增幅最大的是WBL-45组，由46%（12 h）提高至 62%（16 h），增幅为 35%。由此说明，发酵剂的种类和发酵时间均对FBF 抑制S.typhimurium的能力产生较大影响，VHI-41 发酵16 h对S.typhimurium的抑制率为71.8%，在所有处理组中抑菌效果最好。

2.4 不同处理组对S.paratyphi B 抑菌率的影响

由图4 可以看出，CK 组对S.paratyphiB 抑菌率在“0”刻度线以下，即传统工艺制得的牛肉调味料对S.paratyphiB 没有抑制作用。在制备过程中增加发酵环节，FBF 对S. paratyphiB 有显著的抑制作用（P＜0.05）。相比较而言，无论发酵12 h 还是16 h，经 VHI-41 发酵制得的 FBF 对S. paratyphiB 抑菌率均达最高值（发酵12 h 为58%，16 h 为63%）。除VHI-41 之外，其余2 种发酵剂随发酵时间延长制得的FBF 对S. paratyphiB 抑菌率增幅均较大，发酵12 h 时，WBL-45、LS 组抑菌率分别为 60%、69%，发酵16 h 其抑菌率分别上升至70%、76%。

2.5 不同处理组对S.aureus 抑菌率的影响

由图5 可以看出，CK 组对S. aures的抑制率为25%。经3 种发酵剂发酵12 h 后，处理组对S.aureus的抑制率增强，VHI-41 组最高，达61%。当发酵时间延长至16 h 时，WBL-45 组增幅最大，抑菌率由52%（12 h）上升至 67%（16 h）。

3 讨论

3.1 pH 动态变化和各处理组FBF 抑菌能力的相关性

对FBF 制作过程中pH 的动态变化进行监测，各发酵组FBF 的pH 明显低于CK 组，且发酵时间延长，FBF 的 pH 明显降低，其中 VHI-41 组 pH 始终维持在较低水平。观察不同处理组对4 个指示菌的抑制情况，可以发现类似的趋势，即各发酵组抑菌效果优于CK 组，发酵时间延长，抑菌能力提高。VHI-41 组抑菌效果最好，FBF 的抑菌能力可能与乳酸菌生长繁殖过程中提供的低pH 环境有关。

3.2 各处理组FBF 的抑菌差异分析

研究发现，肉品发酵过程中常见的细菌包括乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、微球菌属以及葡萄球菌属几大类[10-11]，这些发酵剂可提高肉品安全性和风味[12-13]。试验所采用的发酵剂包括WBL-45、VHI-41 和LS。其中木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌因能促进肉品蛋白质和脂肪的水解常被用于改善肉制品色泽，提高肉品的食用品质[14]；清酒乳杆菌、植物乳杆菌则能有效降低肉制品中pH，抑制致病菌的生长[15-16]；此外，清酒乳杆菌的代谢产物细菌素也具有较好的抑菌性，目前已报道的清酒乳杆菌细菌素以Ⅱa 类细菌素为主，Ⅱa是分子量小于10 kDa 的小分子热稳定肽[17]，可通过破坏细胞膜完整性，增大膜通透性，引起胞内营养物质外流，进而引起细胞死亡[18]。戊糖片球菌在发酵过程中同样能降低环境pH[19]，产生耐热、耐酸碱、具有广谱抑菌性的细菌素，抑制致病菌和腐败菌的生长繁殖[20]。对比3 组发酵剂组成，VHI-41 发酵剂中乳杆菌比例较高，这可能是VHI-41 发酵剂抑菌效果优于其他两株发酵剂的原因。

4 结论

试验研究3 组发酵剂发酵12 h 和16 h 制得的FBF 的抑菌性能差异。试验结果表明：

（1）CK 组对S. aureus、S. typhimurium、E. coli的抑制率分别为25%、4%、60%，对S.paratyphiB 无抑制作用。发酵处理使得FBF 抑菌率上升。发酵12 h，各组 FBF 对S.aureus、S.typhimurium、E.coli、S.paratyphiB 的抑菌率分别为 52%～59%、46%～66%、76%～83%、60%～78%，随着发酵时间的延长，各处理组抑菌率分别上升至 58%～67%、62%～71%、79%～86%、70%～83%。

（2）3 个发酵剂组中，随着时间的延长，WBL-45组增幅最高，VHI-41 组的抑菌效果最好，发酵16 h对E. coli、S. typhimurium、S. paratyphiB、S. aureus指示菌的抑菌率分别达到86%、71%、63%、59%。对比VHI-41 组12 h 和16 h 的抑菌性差异发现，发酵时间对该发酵剂的抑菌性影响较小。

（3）在保证FBF 抑菌性的前提下，为缩短FBF 的生产周期，可选用VHI-41 发酵12 h 的工艺进行FBF的制作。