男性不育症患者精浆中miR-145的表达水平及其临床意义

林 彤，廖贤平（广州东仁医院生殖医学科，广州 510440）

男性不育症是指未采取任何避孕措施，夫妇同居一年以上由于男性方面的原因导致女方不能受孕者。随着社会的快速发展，生活节奏的不断变化，不育症患病率近年来呈明显上升的趋势，影响了世界范围内大约15%的育龄夫妇，其中男性不育症占20%[1-2]。近年来研究发现，微小核糖核酸(microRNA，miR)参与细胞周期、凋亡的调控，在精子形成和早期胚胎发育等过程中发挥着重要作用，其中miR-145 与精子的发生、凋亡关系密切相关[3-4]。本研究通过检测男性不育症患者精浆miR-145 表达水平，分析miR-145 诊断男性不育症的价值，旨在为男性不育症的诊断及靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年1月～2018年9月深圳市龙华区妇幼保健院收治的男性不育症患者130例，年龄25 ～46（34.20±5.35）岁。纳入标准：①符合世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》中的诊断标准；②婚后性生活正常，未避孕1年以上因男方原因不育者。另招募同期体检正常的生育男性50 例为正常对照组，年龄24 ～43（32.80±4.90）岁。

1.2 主要仪器及试剂 WLJY-9000 伟力彩色精子检测系统（北京伟力公司）。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription 逆转录试剂盒，TaqMan miRNA qPCR 试剂盒，TaqMan small RNA 引物（5×），Taq Man small RNA 引物（20×），ABI 7500 型荧光定量PCR 仪均购自美国ABI 有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集：采集精液前禁欲3 ～7 天，自慰法收集精液于干燥消毒的无菌容器中，置37℃恒温箱中温育30 min，液化后先行精液常规检查，然后1 500 r/min 离心10min，再以12 000 r/min 离心5 min，取上清（精浆）保存于-80℃待检。

1.3.2 精浆RNA 提取：取200μl 预处理的精浆加入1ml TRIzol 中充分均匀，将匀浆液倒入1.5ml 离心管中，再依次加入氯仿、异丙醇及95ml/dl 乙醇，提取总RNA。

1.3.3 miR-145检测：在ABI 7500型荧光定量PCR 仪上进行实时荧光定量聚合酶链反应。反应体系为20μl：TaqMan MicroRNA Assay 1.00μl，cDNA 1.33μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00μl，ddH2O 7.67 μl， 混合后离心放入定量PCR 仪。扩增条件为：95℃预变性10 min、95℃变性15 s、60℃复性60 s 进行45 个循环，实验重复3 次。以U6 为内参照，采用2- △△Ct法计算miR-145 的相对表达水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.4 统计学分析 采用SPSS20.0 统计软件分析，数据以均数±标准差（+s）表示，组间比较采用成组t检验。绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析miR-145 对男性不育症的诊断价值。相关性分析采用Pearson 相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 男性不育症组和对照组精液常规主要参数及精浆中miR-145 表达水平比较 见表1。男性不育症组精浆中miR-145 表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；男性不育症组精子浓度、精子存活率、前向运动精子百分率及正常精子形态百分率明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 男性不育症组和对照组精液常规主要参数 及精浆中miR-145 表达水平比较（+s）

表1 男性不育症组和对照组精液常规主要参数 及精浆中miR-145 表达水平比较（+s）

项 目 对照组（n=50）男性不育症组（n=130） t P精子浓度(×106/ml) 112.50±46.35 70.24±28.60 4.852 0.012精子存活率(%) 73.84±5.82 38.40±7.60 11.238 ＜0.001前向运动精子百分率(%) 46.20±5.30 17.52±9.73 10.816 ＜0.001正常精子形态百分率(%) 9.25±1.70 2.60±1.42 8.913 ＜0.001 miR-145 1.16±0.35 3.92±0.86 7.540 ＜0.001

2.2 精浆miR-145 表达水平对男性不育症的诊断价值 见图1。精浆中miR-145 表达水平诊断男性不育症的曲线下面积（area under curve, AUC）为0.864（95%CI：0.807 ～0.925），当miR-145 取最佳诊断截断值为2.15 时，其敏感度和特异度分别为92.8%和75.0%。

图1 精浆miR-145 表达水平诊断男性不育症的ROC 曲线

2.3 精浆中miR-145 表达水平与精液参数的相关性分析 见图2。Pearson 相关分析显示，男性不育症患者精浆中miR-145 表达水平与精子浓度、精子存活率、前向运动精子百分率均呈正相关（r=0.427，0.604，0.538，P＜0.01），与正常精子形态百分率无相关性（r=0.121，P＞0.05）。对照组精浆中miR-145 表达水平与精子浓度、精子存活率、前向运动精子百分率及正常精子形态百分率均无明显相关性（r=0.153，0.106，0.117，0.096，P＞0.05）。

图2 男性不育症患者精浆中miR-145 表达水平与精液参数的相关性

3 讨论

男性不育症是多因素相互作用而引起的疾病，其发病机制包括遗传因素和环境因素的相互作用，其中遗传因素被认为是导致人类生精功能损伤的重要因素[5]。microRNA 是一类长度为21～25 nt 的内源性单链非编码RNA 小分子，可调节细胞的增殖、凋亡、迁移及分化等过程，在激素、内分泌干扰素和营养状况等多种因素作用下发生特异性变化[6-7]。有研究表明，microRNA 在男性不育、精囊腺及前列腺疾病中异常表达，与精子发生、发育和成熟的过程关系密切[8-9]。CHEN 等[10]使用RT-PCR 技术分析了猪类精液中microRNA 的表达情况，发现精子参数异常的精液中microRNA 的表达序列与正常对照组相比存在差异。

本研究显示，男性不育症组精子浓度、精子存活率、前向运动精子百分率及正常精子形态百分率明显低于对照组，男性不育症组精浆中miR-145 表达水平明显高于对照组，提示精浆中miR-145 在男性不育症患者中呈高表达，其可能参与男性不育症的发生发展。KOTAJA 等[11]研究发现，精浆中microRNA 表达水平上调，可能与精子的减少有关，这为了解男性不育症的发病机制提供依据。本研究通过相关分析显示，男性不育症患者精浆中miR-145 表达水平与精子浓度、精子存活率、前向运动精子百分率均呈正相关。提示miR-145 的高表达可能影响精子的质量。NOVESKI 等[12]研究表明，正常的精子发生与生精障碍的microRNA 具有不同的表达模式，这些差异表达的microRNA 与男性不育症有关。本研究应用ROC 曲线分析显示，精浆中miR-145 表达水平诊断男性不育症的AUC 为0.864（95%CI：0.807～0.925），当miR-145 取最佳诊断截断值为2.15 时，其敏感度和特异度分别为92.8%和75.0%。提示精浆中miR-145 表达水平可能是评估男性生殖能力的生物学指标，有望为男性不育症提供新的治疗靶点。WANG 等[13]研究发现，与对照组相比，精浆中microRNA 在无精子症中显著降低，但在弱精子症中增加，精浆中microRNA 的测定为诊断男性不孕症提供了一种新的无创方法。另有研究显示，正常对照者和不育男性中microRNA表达存在明显差异，microRNA 有潜力作为新的无创生物学标志物来诊断男性不育症[14]。

综上所述，精浆中miR-145 在男性不育症患者中明显上调，且与精子浓度、精子存活率、前向运动精子百分率呈正相关，有望作为男性不育症的辅助诊断指标，同时也为该病的靶向治疗提供新的思路。