油菜蜂花粉蛋白酶法破壁提取及结构表征

王凌波 朱 松 陈尚卫

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)

蜂花粉是花粉与蜜蜂分泌物的混合体，含有丰富的蛋白质、多肽、氨基酸、酚类物质、活性多糖、不饱和脂肪酸和微量活性元素[1-2]，有“完全营养食品”之称[3]。中国每年蜂群采集的花粉量可达20万t，但实际利用的花粉只有6 000 t左右，且以简单杀菌的粗制品为主[4]。

高血压是一种常见的心血管疾病，是危害中老年人健康的头号杀手[5]，目前治疗高血压的药物基本为化学合成药物，均存在一定的副作用[6]。随着生活水平的提高，人们更注重药物和保健品的安全性，食源性产品受到愈来愈多的关注。近年来，有研究者[7-10]发现以蜂花粉为原料开发所得的ACE抑制肽具有降高血压作用。

蜂花粉的细胞壁由内壁和外壁两部分组成。外壁厚而硬，具有特殊的雕刻型花纹图案，主要成分为孢粉素，此外还含有纤维素、生物类黄酮、脂类物质及蛋白质等物质。由于孢粉素是极其稳定的生物聚合物，因此外壁具有耐酸、耐碱、耐腐蚀的特点。内壁的主要成分为纤维素、果胶质、半纤维素及蛋白质，其上有萌发孔，是物质交换的通道，一般条件下萌发孔呈闭锁状态。细胞壁的外壁和内壁会阻碍胞内营养物质的溶出，因此采用破壁处理来提高蛋白的提取率。常见破壁方式有温差—超声复合法[11]、酶解法、超声酶解法[12]、超临界二氧化碳破壁法[13]等。酶法或复合超声酶解法相比其他常见破壁方法，操作更简便快速，能更好保留蜂花粉的活性成分[14]。目前所报道的文献[15-17]多以破壁率、蛋白分散指数来评价破壁效果，此外可溶性糖含量、粒度分析[18]等也可作为评价指标。由于试验的目的是为了促进蜂花粉蛋白的溶出，相比其他破壁指标，以蛋白提取率为评价指标更直观可靠。因此试验拟以蛋白提取率为指标对蜂花粉水溶性蛋白的酶法破壁提取工艺进行优化，并对蜂花粉蛋白进行纯化表征，以期为后续蜂花粉ACE抑制肽的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

油菜蜂花粉：江苏日高峰产品有限公司；

Viscozyme L复合植物水解酶：100 FBG/g，诺维信生物技术有限公司；

其余试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

冷冻干燥机：SCIENTZ-10N型，宁波新芝生物科技有限公司；

定氮仪：KDN103F型，上海纤检仪器有限公司；

扫描电镜：QUANTA 200型，荷兰FEI公司；

台式低速离心机：TD6型，湖南赫西仪器装备有限公司；

傅里叶变换红外光谱仪：NEXUS 670型，美国尼高力公司。

1.2 方法

1.2.1 蜂花粉蛋白酶解提取方法的选择 取2.5 g研磨后的蜂花粉，加入50 mL pH 6.5的水溶液。振荡酶解法是在混合液中加入体积分数2% 100 FBG/g的复合植物水解酶后，40 ℃下振荡8 h；振荡酶解超声法是在混合液中加入体积分数2% 100 FBG/g复合植物水解酶后，先于40 ℃下振荡4 h，再在频率40 kHz，功率250 W条件下超声处理4 h。每个试验组在8 h后以4 000 r/min的转速离心20 min，取5 mL上清液，测定其蛋白质含量，按式(1) 计算蛋白提取率。各组离心后所得沉淀用3 500 Da 透析袋除糖后，浓缩冻干，进行电镜表征及氨基酸组成、红外光谱、圆二色谱分析。

(1)

式中：

c——蛋白提取率，%；

m1——所取上清液中蛋白含量，mg；

m2——蜂花粉蛋白含量，mg；

V——上清液总体积，mL。

1.2.2 蜂花粉蛋白酶解提取单因素试验 根据1.2.1结果确定提取方法后，以蛋白提取率为评价指标，进行单因素优化试验。固定水溶液pH值为6.5、酶解温度42 ℃、酶解时间6 h，考察加酶量(体积分数0.04%，0.10%，0.20%，0.40%，1.00%)对蛋白提取率的影响；固定加酶量为体积分数0.40%、酶解温度42 ℃、酶解时间6 h，考察提取液pH(3，4，5，6，7，8)对蛋白提取率的影响；固定加酶量为体积分数0.40%、水溶液pH值为6.5、酶解时间6 h，考察酶解温度(30，40，50，60，70 ℃)对蛋白提取率的影响；固定加酶量为体积分数0.40%、水溶液pH值为6.5、酶解温度42 ℃，考察酶解时间(3.0，4.5，6.0，8.0，10.0 h)对蛋白提取率的影响。

1.2.3 响应面优化蜂花粉蛋白提取条件 根据单因素试验结果，选择对蛋白提取率影响较大的3个因素，以蛋白提取率为响应值，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理进行三因素三水平的响应面分析试验。

1.2.4 蜂花粉基本成分分析

(1) 水分的测定：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法。

(2) 灰分的测定：参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中的第一法。

(3) 蛋白质的测定：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。

(4) 脂肪的测定：参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法。

1.2.5 蜂花粉水溶性蛋白的纯化和表征 将15 g蜂花粉原料经优化酶解破壁、冷冻干燥后，加入至5 mL pH 6的PBS缓冲液中溶解，吸取2 mL上述溶液加入至已填充平衡完毕的Sephadex G-100凝胶柱中。用pH 6的PBS缓冲液洗脱，流速为1 mL/min，用部分收集器收集。将所得峰组分置于3 000 Da透析袋中透析48 h。透析完成后对各组分分别进行冷冻干燥，最后用凯氏定氮法测定样品中蛋白质量，用OPA衍生化—高效液相法[19]测定水解氨基酸含量，并对蛋白进行圆二色谱[20]和傅里叶红外光谱分析[21]。

1.2.6 数据分析 采用Origin 2016软件处理数据并绘图，采用Design Expert 8.0软件进行响应面优化分析，采用SPSS 19.0进行方差与显著性分析(P<0.05)，采用Chirascan软件对圆二色谱图进行数据处理。所有试验重复3次，取其平均值，并计算标准偏差。

2 结果与分析

2.1 蜂花粉基本成分分析

蜂花粉的组成成分受植物来源、气候、环境等多种因素的影响[22]。试验所用蜂花粉原料的水分、灰分、脂肪、蛋白含量如表1所示。结果与Ares等[23]和Yang等[24]的报道基本相符。

表1 蜂花粉基础指标含量

2.2 蜂花粉蛋白酶解提取方法的选择

蜂花粉的细胞壁由内壁和外壁两部分组成。外壁较为坚硬，主要由孢粉素、纤维素和蛋白质等物质组成，呈特殊雕纹，其中孢粉素耐压、耐酸碱，不易被分解。内壁的主要成分为纤维素、果胶质、半纤维素及蛋白质，其上有萌发孔，是物质交换的通道，一般条件下萌发孔呈闭锁状态。

如图1(a)所示，酶解处理后的雕纹状的蜂花粉细胞外壁几乎已经完全脱落，细胞内壁被破坏，产生细胞碎片。如图1(b)所示，经振荡酶解超声处理后，蜂花粉的细胞外壁和内壁也被破坏，但破坏程度弱于振荡酶解。振荡酶解的蛋白质提取率为(51.80±1.01)%，振荡酶解后超声法的蛋白提取率为(48.60±0.67)%，与图1所示的试验结果相吻合。这可能是由于频率40 kHz，功率250 W，时间4 h的超声条件影响了复合植物水解酶的活性。一般低强度的超声能使酶活增强，超声效应会导致媒介局部压力和温度的急剧升高，蛋白质发生折叠化的可能性增强，折叠化的蛋白质会暴露更多的基团，从而其和酶的亲和力增强[25]。比如Nguyen等[26]发现，纤维素酶在经过频率20 kHz，密度6 W/L，时间60 s的超声处理后，其酶活提高了18.7%。但是当超声强度过大、超声时间过长时，酶的构象会因超声处理而改变，从而影响酶的活性。试验所用的超声条件可能降低了复合植物水解酶的活性，因此蛋白质提取率低于振荡酶解。

图1 不同提取方法的电镜表征

2.3 蜂花粉蛋白提取条件的优化

2.3.1 建立回归模型及方差分析 根据单因素结果，确定如表2所示的因素水平表，试验设计及结果见表3。

表2 响应面试验因素水平设计

表3 试验设计与结果

采用Design Expert 8.0软件对表3试验数据进行回归分析，得到蛋白提取率与振荡酶解各因素变量的二次模拟方程：

Y=77.47-0.13A-0.81B+1.41C+0.095AB+0.015AC-0.75BC-2.52A2-1.00B2-0.97C2。

(2)

对表3中的试验结果进行统计分析，方差分析结果如表4所示。

由表4可知，该模型P=0.000 5<0.01(极显著)，失拟项P=0.180 9>0.05(不显著)，表明该回归模型与试验数据很吻合，试验误差较小，模型选择正确。B、C的一次项均达到极显著水平，表明酶解温度、酶解时间对蛋白提取率有显著影响，影响效果为酶解时间>酶解温度。A的一次项未达到显著水平，表明当水溶液的pH值为5～7时，对蛋白提取率的影响不显著。交互项中BC项P值<0.05，二次项A2、B2、C2对蛋白提取的曲面效应显著，表明各因素对蛋白提取的影响不是简单的线性关系。

表4 方差分析

2.3.2 响应面分析 作出响应面图，分析水溶液pH值、酶解温度、酶解时间对蛋白提取率的影响情况，结果如图2所示。

图2 蛋白提取率响应曲面图

由图2可知，水溶液的pH和酶解温度、酶解时间的交互作用显著，而酶解温度和酶解时间的交互作用较小。

2.3.3 最优工艺组合的确定及验证 通过Design Expert 8.0软件分析对回归方程进行优化拟合得，振荡酶解提取蜂花粉蛋白的最佳条件为：水溶液pH 5.96，酶解温度42.14 ℃，酶解时间6.50 h，该条件下蛋白提取率的预测值为78.53%。为检验该结果的可靠性，进行3次重复验证实验，因试验设备条件限制，设置条件为：水溶液pH 5.96，酶解温度42.0 ℃，酶解时间6.5 h，得到蜂花粉蛋白提取率平均值为79.53%。

2.4 蜂花粉蛋白的纯化和表征

2.4.1 蜂花粉蛋白的纯化 试验选择的Sephadex G-100凝胶柱可用来分离4～150 kDa范围内的蛋白质。蜂花粉提取液通过Sephadex G-100后共得到如图3所示的4个不同的组分峰，经凯氏定氮法测定只有峰1中含有蛋白质，其蛋白含量为(66.77±2.11)%。

图3 蜂花粉蛋白Sephadex G-100凝胶层析分离图

2.4.2 蜂花粉蛋白的表征 如表5所示，蜂花粉蛋白的水解总氨基酸含量为63.49 g/100 g，其中疏水性氨基酸含量为27.52 g/100 g，占总氨基酸含量的43.35%；芳香族氨基酸Tyr、Trp和Phe三者的总含量为8.98 g/100 g。

表5 水解氨基酸含量

Sarmadi等[27]研究表明疏水性氨基酸可以增强肽和脂类物质的相互作用，使活性肽更易进入靶器官或目标位点，从而增强肽的生物活性。芳香族氨基酸能通过提供多余电子来提高肽的生物活性。此外根据文献[28]可知，C末端连有疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的肽结合ACE的活性强。因此，具有较高疏水性氨基酸含量和芳香族氨基酸含量的蜂花粉蛋白是制备功能性低聚肽的良好材料[29]。

如图4所示，蜂花粉蛋白在3 500 cm-1附近出现吸收峰，是由N—H的振动引起的，吸收峰的个数只有一个，因此可能为仲胺、仲酰胺或酰亚胺，考虑到蛋白质的肽键是一种酰胺键，并且此峰为尖锐强吸收峰，所以此蜂花粉蛋白可能含有较多的仲酰胺。1 450，1 600 cm-1处的吸收峰为芳环特征峰，与表5所得结果相同，说明此蛋白中存在芳香族氨基酸。

图4 蜂花粉蛋白的红外光谱图

图5 蜂花粉蛋白的圆二色谱图

表6 蜂花粉蛋白的圆二色谱数据处理结果

利用Chirascan软件对圆二色谱图(图5)进行数据分析结果(表6)表明，α螺旋、β折叠结构具有一定的刚性，是二级结构中的有序结构。β转角和无规则卷曲结构没有刚性，其两者含量越高，代表蛋白分子的有序性越弱[30]，蛋白更易被水解。此蜂花粉蛋白中β转角和无规则卷曲结构占到54.2%，说明其有序性较弱，易被蛋白酶酶解。

3 结论

通过单因素试验和响应面优化试验，确定油菜蜂花粉提取的最佳条件为：将2.5 g峰花粉和50 mL pH 5.96的水溶液混合后，加入体积分数0.4%的复合植物水解酶(100 FBG/g)，42 ℃振荡酶解6.5 h，此条件下蛋白提取率为79.53%。通过Sephadex G-100凝胶层析法对蜂花粉水溶性蛋白进行纯化，其氨基酸组成、红外谱图和圆二谱图结果表明油菜蜂花粉蛋白的有序性较弱，易被酶解，并且含有较高含量的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸，是制备ACE抑制肽的良好原料。后续将对ACE抑制肽的制备及分离纯化进行研究，以获得来源于油菜蜂花粉蛋白的高活性ACE抑制肽。