花色苷的生物活性及提取、分离纯化研究

李京城　张唐伟　兰小中　张国强

摘 要：花色苷是一种天然色素，具有抗氧化、降血脂、抗衰老等生物活性，在食品、医药行业具有广大的应用前景。该文综述了花色苷提取工艺、分离纯化技术和生物活性的最新研究成果，并总结了花色苷发展需要解决的问题，旨在为花色苷进一步研究提供参考。

关键词：花色苷;提取;纯化;生物活性

中图分类号 TS264.4文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）13-0140-05

Abstract： Anthocyanins ，a kind of natural pigments with biological activities such as antioxidant， hypolipidemic， and anti-aging， and has broad application prospects in the food and pharmaceutical industries. The article summarizes the latest research results of anthocyanin extraction technology， separation and purification technology and biological activity， and summarizes the problems that need to be solved in the development of anthocyanins，and aims to provide a reference for the further research of anthocyanins.

Key words： Anthocaynins;Extraction;Purification;Biological activities

花色苷（Anthocaynins）是一种存在于茎、叶、花、果实、种子等植物器官的水溶性天然色素[1]，属于多酚类化合物，由花色素和糖分子通过糖苷键缩合形成[2]。花色苷种类繁多，因其糖苷键位点和碳环上取代基不同，花色苷大致有500多种，花色素有20多种，其中植物中最常见的花色素有6种[3]。花色苷不仅能使植物呈红、蓝、紫等颜色[4]，还具有抗氧化、降血糖、抗炎、抗癌等生理活性[5-7]，可以应用于食品、化妆品、医药等领域。花色苷来源广泛，获取途径繁多，原材料成本低，而傳统的提取方法有较多杂质，不利于花色苷的定性、定量分析，因此对花色苷提取、分离、纯化工艺优化和生物活性研究很有必要。本文对花色苷提取工艺、分离纯化及生物活性等研究进行综述，以期为花色苷的进一步研究提供参考。

1 花色苷生物活性

1.1 抗氧化活性 抗氧化活性是花色苷的一个重要生物活性，有研究表明，植物花色苷通过清除细胞内活性氧来维持机体正常生理活动[8]。抗氧化活性与酰基化基团、糖基化位点及数量密切相关[9]。高品[10]等从紫甘薯、黑枸杞、黑加仑和桑椹中提取花色苷，选择具有代表性含量高的花色苷纯化至单体，比较其抗氧化能力。研究发现DPPH自由基清除能力：矢车菊-3-O-葡萄糖苷>矢车菊-3-芸香糖苷>矮牵牛素-3-O-对香豆酰芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷>芍药素-3-咖啡酰-阿魏酰槐糖苷-5-葡萄糖苷>Vc;对羟基自由基清除能力：勺药素-3-咖啡酰-阿魏酰槐糖苷-5-葡萄糖苷>矢车菊-3-O-葡萄糖苷>矮牵牛素-3-O-对香豆酰芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷>矢车菊-3-芸香糖苷>Vc，几种花色苷单体的DPPH、羟基自由基清除能力均大于Vc。张丽霞[11]等考察了黑莓花色苷对血管内皮细胞存活率、抗氧化酶活性和凋亡率的影响，发现内皮细胞存活率和过氧化物酶活性提高近50%，早期凋亡率和晚期凋亡率极显著下降（P<0.01），研究表明黑莓花色苷对由H2O2诱导的内皮血管细胞损伤有保护作用。周丽萍[12]等以低、中、高3组剂量喂养小鼠蓓蕾蓝靛果花色苷，考察丙二醛（MDA）、蛋白质羰基、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽的含量，发现小鼠体内的丙二醛和蛋白质羰基极显著降低（P<0.01），而超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽的含量极显著上升（P<0.01），得出结论蓓蕾蓝靛果花色苷对乙醇诱导的氧化损伤有抑制作用。

1.2 降血脂作用 王心哲等将小鼠分为对照组、高脂组和花色苷干预组进行8周喂养，发现与高脂组相比，花色苷干预组小鼠的腹部脂肪和肾周脂肪显著降低（P<0.05）;通过对总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）等与高血脂症及动脉粥样硬化有关影响因素的含量，发现TG和LDL含量显著下降，TC有下降趋势，HDL含量干预组相比较高脂组有所升高，表明黑米花色苷有降血脂和抗动脉粥样硬化的作用。于伟[13]等研究了蓝靛果花色苷降血脂分子机制，发现蓝靛果花色苷能显著提升低密度脂蛋白受体（LDLR）和mRNA表达量，而血液中绝大部分胆固醇与LDL结合被LDLR清除和吞噬，所以血脂含量降低;同时研究发现，蓝靛果花色苷能显著增加胆固醇逆转运途径中ATP结合转运蛋白，调控胆固醇逆转运。

1.3 其他生物活性 大量研究报道，花色苷不仅具有抗氧化活性和降血脂作用，还具有其他一些生物活性。如薛宏坤[14]等考察了体外蓝莓花色苷抗癌作用，当花色苷浓度从100mg/L上升至300mg/L时，HepG2肝癌细胞存活率降低了29.2%;A549肺癌细胞存活率液显著下降（P<0.05），Hela人宫颈癌细胞存活率由（90.00±1.60）%下降到（63.30±1.50）%，下降了28.7%，综上证明蓝莓花色苷对3种癌细胞的生长有抑制作用。杜灵敏[15]等对农大4号欧李果实花色苷在D-半乳糖致衰老小鼠保护作用进行了研究，发现农大4号欧李果实花色苷通过降低小鼠体内MDA（衰老指标）含量，提高总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，达到延缓小鼠衰老的目的。机体通过自噬清除机体内有异常细胞组分和积聚蛋白质来维持正常代谢，有研究[16]表明飞燕草素葡萄糖苷可以活化自噬相关信号通路，来改善记忆和认知功能障碍。此外还有研究报道花色苷具有抗炎作用[17]、抗诱变作用[18]、保护视力[19]等。

2 花色苷的提取工艺

在花色苷研究中，花色苷提取工艺是极其重要的环节，不适宜的提取工艺可能导致花色苷降解，得率降低。近年来常见的提取方法有机溶剂提取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法、超临界CO2萃取法、酶提取法等。

2.1 有机溶剂提取法 有机溶剂提取法常用溶剂为水-乙醇、水-甲醇和水-丙酮的混合溶剂，通过水浴加热、旋转浓缩、冷冻干燥等步骤得到花色苷样品。因为花色苷在中性和碱性环境中不稳定[20]，故常常在提取溶剂中加入少量有机酸或盐酸。李雨浩[21]等分别以水、60%乙醇、1%柠檬酸和60%乙醇、60%甲醇、1%柠檬酸和60%甲醇为溶剂提取黑果腺肋花楸花色苷;李金星[22]等以酸性甲醇、酸性乙醇、酸性丙酮为提取剂提取蓝莓花色苷;赵桃[23]等以70%甲醇、70%乙醇为提取剂提取黑青稞花色苷。结果表明同体积分数提取剂提取率：乙醇>甲醇>丙酮，然而也有不同研究报道甲醇为提取剂提取率高于乙醇，可能是组成花色苷样品的成分和结构差异造成的[24]。陈雅妮[25]等通过正交试验确定玫瑰花色素的最佳提取工艺为40%乙醇溶液、料液比1∶40（g/mL）、70℃提取4h。张笑菊[26]等用响应面优化法确定紫甘蓝花色苷最佳提取工艺40%乙醇、温度41℃、料液比1∶36（g/mL），此条件下提取率最高13.92mg/g，其中温度和乙醇浓度、料液比和乙醇浓度都存在明显的交互作用。由此可见，有机溶剂提取法影响花色苷提取率的主要因素为提取温度、提取时间、料液比、pH和提取剂体积分数。

溶剂提取法具有操作简单、所需提取设备要求及成本低等优点，同时也有着提取时间长、提取效率低和部分提取溶剂有害等不足。越来越多的研究人员通过超声辅助提取、微波辅助提取等方法提取花色苷，来避免溶剂提取法的不足。

2.2 超声辅助提取法 超声辅助提取法是利用超声波辐射产生的机械效应与空化作用加速细胞的破碎，热效应加速花色苷溶解[27]，从而达到高效提取花色苷的目的。蒋华梅[28]等利用超声辅助法确定了插田泡花色苷最佳提取工艺为超声时间22min、超声功率141W、乙醇体积分数74.5%、料液比1∶40（g/mL），最佳提取率263.15mg/g，相比普通溶剂提取法提取率显著提高。朱凤妹[29]等通过单因素试验探索了温度、提取时间和料液比等工艺条件，利用响应面优化法确定黑果肋花楸花色苷最佳提取工艺40%乙醇溶液（含0.5%乙酸）、提取温度43℃、超声时间23min、料液比1∶89（g/mL），提取率最高可以达到0.79%。杜道坤[30]等利用响应面优化法确定了黑青稞最佳提取工艺，在最佳提取工艺的基础上使用超声提取40min，提取率从9.68mg/100g提高到14.04mg/100g，不仅缩短了提取时间，还提高了提取效率。

超声辅助提取法具有提取时间短、效率高、能耗少、提取所需试剂少（降低了提取次数）等優点。值得注意的是超声时间不宜超过30min，提取时间过长容易导致反应体系温度升高，花色苷降解，提取率降低、设备损耗增加。这种两种或以上的协同提取方法有着巨大的经济价值和环保效益，可以弥补单一提取方法的不足，应该加以广泛利用。

2.3 微波辅助提取法 微波辅助提取是利用高频微波使植物细胞内极性物质吸收大量微波能，造成细胞内温度迅速上升形成压力差，使细胞壁出现裂纹和孔洞，从而有利于溶剂进入细胞内溶解释放花青素。王心哲[31]等探索了黑米花色苷的微波提取工艺，通过对微波功率、微波时间、提取液pH及料液比影响因素的考察，正交分析得到最佳工艺参数微波功率600W、时间7.5min、pH为5、料液比1∶4（g/mL），花色苷得率最高可达到1.28%。刘雪可[32]等分别使用常温溶剂提取法、加热溶剂提取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法4种方法从蓝靛果果渣中提取花色苷，结果显示微波提取只需用40s，花色苷得率就达到0.23%，相比常温溶剂提取、加热溶剂提取和超声辅助提取得率分别提高了78.1%、73%、75%，而3种提取法所需时间分别为90min、90min、35min。朱璐[33]等使用浸提法、超声波法和微波法的最佳提取工艺提取紫薯花色苷并比较了3种提取方法所得花色苷的6种抗氧化能力（羟基自由基、DPPH自由基、超氧阴离子、铁离子还原力、总抗氧化能力、金属螯合能力），结果表明除金属螯合能力较差，其余5种抗氧化能力中微波法>超声波法>浸提法，紫薯花色苷采用微波提取法，抗氧化效果最佳。

因此，微波辅助提取法具有耗时短、能耗小、效率高等优点，但是微波提取花色苷受微波功率和时间的影响较大，随着时间和功率的增加，反应体系温度急剧上升，导致花色苷降解，得率下降。现在用于工厂生产的微波设备技术相对滞后，应用于大规模生产能力不足，未来应该加大微波提取设备在规模化生产方面的研究。

2.4 超临界CO2萃取法 超临界CO2萃取法是指对CO2施加温度和压力，使它达到超临界态，此时的CO2是既非气态又非液态的单一相，既具有气体的穿透性又具有液体的溶解度，能够快速准确地萃取所需物质[34]。常见的超临界流体有CO、CO2、N2O、NH3等。其中CO2临界温度31.1℃、化学性质稳定、价格低廉、无毒害，特别适用于花色苷的萃取。田密霞[35]等通过单因素试验确定了蓝莓花色苷超临界CO2萃取的影响因素为萃取压力、萃取时间、萃取温度和料液比，利用Box-Behnken响应面优化得到最佳提取工艺为萃取压力28Mpa、萃取时间60min、萃取温度40℃、料液比7∶1（mL/g）。相比较溶剂提取法，超临界CO2萃取法有着安全无毒、提取纯度高、提取物质损耗少等优点。

此外，花色苷的提取方法还有超高压提取等方法。杜月娇[36]等采用超高压法提取山葡萄花青素，通过响应面优化得到最佳提取工艺为压力200Mpa、保压时间2min、料液比1∶8.5（g/mL），相较于传统的热浸提法，提取率提高了26.7%。不同来源样品的组成成分不同，其花色苷种类和结构也不同，因此不同样品花色苷的提取需要综合考虑成本、耗时、用途等多个方面来制定提取工艺。

3 花色苷分离纯化

通过有机溶剂提取法提取的花色苷中含有糖、蛋白质、有机酸和淀粉等杂质，不利于花色苷的保存、定性分析和其他生理活性的研究，因此需要对花色苷提取液进行分离纯化。目前，常见的纯化方法有柱层析法（包括大孔树脂柱层析、聚酰胺柱层析、凝胶柱层析和离子交换树脂柱层析）、纸层析、薄层层析、高速逆流色谱法、膜分离法、两相萃取法等。

3.1 大孔树脂吸附法 大孔树脂是一种安全无毒的分离材料，具有成本低、操作简单、可重复利用等优点。大孔树脂吸附的原理是利用固定相和流动相之间的范德华力或生成氢键，同时多孔结构对分子大小不同物质进行筛选，以达到分离纯化目的[37]。谭佳琪[38]等比较了6种大孔树脂的静态吸附和解吸能力，初步筛选出AB-8、XAD-700有较强吸附性，X-5解吸率最高，原因是2种树脂极性相似，易与花色苷分子形成氢键紧密结合[39]，X-5大孔树脂因为有较大的孔径而易于被洗脱下来[40]。通过静态吸附和解吸动力学曲线，最终确定AB-8树脂效果最好，从动力学和热力学的角度探索了吸附行为和吸附机制，得出结论AB-8大孔树脂对树莓花色苷的吸附属于单层物理吸附，吸附过程为放热过程，洗脱液流速和洗脱剂浓度为3mL/min、60%时，回收效果最好。余亚选[41]等筛选出D101大孔树脂纯化美洲合欢花花色苷，最佳工艺参数是上样浓度1.5mg/mL、pH2.0、上样流速2mL/min、60%酸化乙醇1mL/min洗脱。采用液相色谱法对比纯化前后花色苷发现纯化后花色苷峰值增加，杂峰减少。徐华荣[42]等使用AB-8大孔树脂探究了紫马铃薯的纯化工艺，在单因素试验基础上，通过正交优化分析得到最佳纯化工艺上样浓度0.5mg/mL、pH2.0、上样流速1mL/min，洗脱液乙醇浓度70%、pH1.0、洗脱流速1mL/min，纯化后花色苷色价比纯化前提高8.43倍。不同样品花色苷因为其组成结构不相同所以筛选的大孔树脂也不尽相同，这与大孔树脂的比表面积、孔径、极性和分子间作用力有关。

3.2 高速逆流色谱法 高速逆流色谱是一种液液色谱分配技术，利用物质在两相间分配系数的差异实现分离。因为其流动相和固定相都是液体，避免因不可逆吸附引起的样品损失、失活、变性等，同时被分离物质在两相之间充分接触，能够高效、大量的分离样品[43]。易建华[44]采用高速逆流色谱纯化紫甘蓝花色苷，以正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-水-三氟乙酸（2∶2∶1∶5∶0.01，V/V/V/V）为溶剂系统，得到3种化合物，纯度分别为76.28%、45.46%、91.46%。李媛媛[45]采用乙腈-正丁醇-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸（1∶40∶1∶50∶0.01）为溶剂体系，纯化红葡萄皮花色苷得到飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和芍药色素-3-O-葡萄糖苷，纯度分别为93.7%、95.2%、91.6%。薛宏坤[46]以正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-水-三氟乙酸（2∶2∶1∶5∶0.01，V/V）为溶剂体系，纯化桑葚花色苷得到飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，纯度分别为和92.27%、94.05%、90.82%。花色苷的生理活性是近年研究的热点，但花色苷种类繁多，大规模制造花色苷的单体难以实现。高速逆流色谱操作简单、成本低、高效量大的优点，具有广大市场前景。

3.3 联合纯化方法 因为花色苷种类和结构的复杂性，单一的纯化方法对有些植物花色苷的纯化效果不佳，联合纯化花色苷的研究相继报道。如刘静波[47]等将蓝莓超声浸提，乙酸乙酯萃取制得蓝莓花色苷粗提液，通过XAD-7HP大孔树脂吸附、Sep-Pak C18固相萃取、Sephadex LH-20凝胶色谱柱分离，经高效液相色谱检测上述所得飞燕草素-3-O-半乳糖苷和锦葵色素-3-O-半乳糖苷，纯度为96.98%、95.63%。经过计算发现2种花色苷单体的回收率仅有10.4%、17.5%，这是因为大孔树脂和凝胶色谱柱能造成总花色苷50%以上的损失。于泽源[48]等采用大孔树脂-中压柱层析联用分离纯化蓝莓花色苷，经HPLC-MS测定花色苷单体为矢车菊-3-O-葡萄糖苷，纯度为90.88%。薛宏坤[49]等采用AB-8大孔树脂-Sephadex LH-20凝胶柱层析联用的方法纯化黑加仑花色苷，通过HPLC-MS检测分析得出2种花色苷单体，分别是飞燕草素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷。

除此之外，花色苷分离纯化还有其他一些方便、快捷的纯化方法。如万莹[50]等采用微滤-超滤膜联用技术纯化紫薯花色苷，膜分离技术有着经济、环保和维持花色苷活性等优点。陈亮[51]等采用Zorbax SB-C18柱固相萃取桑椹花色苷，分离纯化得到3种花色苷，分别是矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-芸香糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷，含量占总花色苷的67.52%、31.29%和1.06%。不同的纯化方法各有优缺点，因此，针对不同的植物花色苷，应在前人的研究基础上，积极探索新的高效的纯化方法。

4 展望

花色苷具有极强的生理保健作用和出色的医疗应用价值，在食品、化妆和医药等行业拥有着广泛的市场前景。但在应用还需要解决以下几方而问题：（1）花色苷在具有天然色素安全无毒优点的同时，也具有天然色素稳定性差的不足。有研究[52]报道对花色苷分子进行结构修饰，可以提高其稳定性，但目前根据实际需求精准批量化修饰花色苷分子结构的研究不足。（2）缺乏高效、经济、环保的提取纯化技术，不足以满足大规模工业化生产。花色苷提取纯化面临着提取率低、损耗大和花色苷单体分离成本高等困难。目前市面上售卖的花色苷单体种类较少，价格昂贵，大规模制备花色苷单体技术具有巨大的经济价值。（3）尽管花色苷具有诸多有益的生物活性，但自然界花色苷种类高达500多种，具体某种花色苷单体具有的生物活性和对应生物活性的调控机制的研究不足。单一花色苷提取纯化工艺，总有某些方面的不足，多种方法联用可以避免这些不足之处的同时，还可以提高花色苷产量和纯度。我国有着丰富的花色苷资源，随着技术的进步，花色苷产业的发展会越来越快，可以为我国带来巨大的经济效益和社会效益。

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（责编：王慧晴）