UPLC法测定西洋参保健食品中13种人参皂苷的含量

程燕，谭顺中，伍蓉，郑蓉，熊有明

重庆市万州食品药品检验所（万州 404000）

西洋参保健品以西洋参或西洋参提取物为主要原料，是具有滋补或特定保健功能的产品，归属于传统滋补类保健品大类[1-2]。研究表明，人参皂苷是人参的主要药效成分[3-6]。因此人参皂苷的种类及其含量常用来评价人参的品质，也被作为评价人参类保健食品品质的主要指标。目前测定人参类保健食品功效成分人参皂苷的常用方法为《保健食品检验检测规范》的紫外分光光度法和高效液相色谱法。紫外分光光度法测定的是总皂苷的含量，该方法前处理复杂，干扰较大，准确性差，重现性一般；高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏、重现性好、应用范围广等特点，但是人参皂苷类成分结构差异多数在糖的位置和数量，因此极性非常相近，在一般C18色谱柱上的保留行为相似，难以达到很好的分离，为获得满意的分离效果，色谱分析时间在80 min以上。UPLC借助于HPLC的理论和原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积等全新技术，具有超高速度、超高柱效、超高分离度、高灵敏度等优势，极大地缩短了分析时间。Kinetex F5色谱柱（五氟苯基柱）采用重现性极高的五氟苯基丙基相，完美融合了核-壳性能和疏水性、芳香性、静电作用、立体/平面结构、氢键5种相互作用机理，能够提供色谱分析中化合物分离所需的极性、疏水性、芳香性和结构选择性。5种相互作用机理分别为：链和苯环骨架的疏水性，可保留中性/疏水性物质；在非乙腈流动相中，碳环的π-π电子与分析物的π-π电子相互作用，可提升保留效果；高负电性含氟基团产生的偶极矩，有助于保留极性化合物，诱导偶极矩也有助于中性化合物的保留；结构选择性可以实现传统烷基相无法实现的异构体分离；分析物极性官能团与吸电子的含氟基团相互作用形成氢键，从而形成极其有效的保留机制。

试验采用Kinetex F5柱，建立了UPLC测定西洋参保健食品中13种人参皂苷含量的方法，并对市售的5批西洋参保健食品进行测定，根据测定结果，以皂苷总量、Rb1/Rg1的比例和Rf为指标评价样品品质。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪（Waters ACQUITY UPLC）。

人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg2对照品、人参皂苷Rc对照品、人参皂苷Rb2对照品、人参皂苷Rb3对照品、人参皂苷f1对照品、人参皂苷Rd对照品、人参皂苷f2对照品、人参皂苷Rg3对照品、人参皂苷Rh2对照品；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；超纯水。

1.2 色谱条件

Kinetex F5柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）。流动相A为水，流动相B为甲醇。梯度洗脱：0～6 min，83% A→80% A；6～7.5 min，80% A→70% A；7.5～11 min，70% A；11～13 min，70% A→60% A；13～15 min，60% A→21% A；15～20 min，21% A→5%A；；20～21 min，5% A→0% A；；21～22 min，0%A→83% A；22～25 min，83% A→83% A。流速0.4 mL/min，柱温35 ℃，检测波长203 nm，进样量2 μL。

1.3 标准溶液制备

标准储备液：精密称取适量上述13种药物对照品，分别用甲醇溶解制成质量浓度约为1 mg/mL的标准储备液，于-10 ℃冰箱中保存备用。

标准溶液液：分别吸取适量上述标准储备液，以初始流动相为稀释液，配制成所需浓度的混合标准溶液。

1.4 供试溶液制备

称取适量供试品，研细，置于50 mL离心管中，加入50 mL 80%甲醇水，超声20 min，定容至刻度，过0.22 μm滤膜，待测。

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 线性范围及检出限

按1.3小节进行配制质量浓度为2～200 μg/mL的混合标准溶液，以峰面积对对照品浓度（μg/mL）进行回归分析，按S/N=3计算检出限。13种人参皂苷在2～200 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.998～0.999。检出限详见表1。

2.1.2 重复性和稳定性

取6份同一样品，按1.4小节处理，进样分析，测得RSD为1.05%～4.08%，表明该方法重复性良好。供试品溶液放置1，2，6，12和24 h后分别进样，13种皂苷峰面积的RSD为0.21%～1.07%，说明在24 h内待测组分稳定性较好。

2.1.3 回收率

称取9份同一份已知本底值的样品，加入适量标准混合溶液，按1.4小节处理，测定加标回收率。13种人参皂苷的回收率见表1。

表1 13种人参皂苷的回收率、精密度（n=3）及检出限

接表1

2.2 实际样品的测定

2.2.1 单一人参皂苷的含量

应用该方法对13批人参类保健食品进行分析测定。5批样品中，13种人参皂苷的结果见表1。从单一皂苷成分来看，5批样品中含量较高的人参皂苷为Rb1，Rb3，Re，f1，Rd，含量较低的为Rg3，基本不含人参皂苷Rh2和Rf。Rb1/Rg1的比值为0.61%～10.64%，Rb1、Rb2、Rc、Re、Rg1、Rd的总和为1.75%～6.75%，详细数据见表2。

2.2.2 原人参二醇型和原人参三醇型人参皂苷的含量

人参皂苷根据苷元部分的不同可以分为3类：原人参二醇型皂苷，包括Ra1，Ra2，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Rg3，Rh2，f2，糖苷基PD；原人参三醇型皂苷，包括Re，Rg1，Rf，Rg2，Rh1，f1糖苷基PT；齐墩果酸型皂苷，包括人参皂苷Ro[7-8]。此次试验将测得的13种人参皂苷按这3种类型分别计算其含量，结果见表2。5批样品中4批样品的原人参二醇型皂苷含量高于三醇型，1批样品的原人参二醇型皂苷含量略低于三醇型。

表2 样品测定结果表

3 讨论

3.1 样品提取方法的选择

在参考文献[9]的基础上，试验选择80%甲醇水溶液为提取溶剂，考察了超声提取和液液萃取2种方法制备供试品溶液。结果表明，液液萃取方法复杂且大部分化合物不会显著提高提取效率，故采用超声提取制备供试品溶液。

3.2 色谱柱的选择

结合人参皂苷类化合物的性质和Kinetex F5柱特征，选择Kinetex F5。经改变流动相梯度，13种人参皂苷类化合物能在15 min内分析完毕，并全部能达基线分离，标准溶液色谱图和样品色谱图见图1和图2。

图2 样品色谱图

3.3 样品品质评价

查阅大量研究人参皂苷分析方法的文献发现，大多数研究将皂苷总量和Rb1/Rg1的比例作为人参产品的标准化指标，此外可用标记化合物的存在与否进行种类鉴别[10-14]。通常Rb1/Rg1比值为1～3，这是人参（亚洲人参）的特点[10]，西洋参根提取物Rb1/Rg1比值较大，一般10以上[10]，而西洋参茎叶提取物该比值比较小，有研究表明大都小于1[15]。在皂苷总量方面，美国药典西洋参和人参根提取物的专论中人参皂苷的总量以人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re、Rg1、Rd的总和计算，使用高效液相色谱-紫外法测定，西洋参根人参皂苷的含量不低于4%。在标记化合物的存在与否方面，据报道人参皂苷Rf不存在于西洋参，可用于排除掺假[10]。

根据上述指标对所测的5批样品进行品质评价。5批样品均不含Rf，符合西洋参不含人参皂苷Rf这一规律。此外，样1和样5的Rb1/Rg1大于10%，Rb1等6种皂苷的总量超过4%，符合西洋参根部提取物特征；样2和样3的Rb1/Rg1的比例为1%左右，符合西洋参茎叶提取物特征。样4的测定结果出现一定偏差。样4出现异常情况，一方面可能跟采用的方法不同有关，通过大量研究人参皂苷分析方法的文献发现，采用不同的方法，定量结果会出现一定偏差；另一方面也不排除样4存在品质问题。

张玉婷等[15]研究发现西洋参根提取物、西洋参茎叶提取物中二醇型皂苷含量均高于三醇型，此次试验样品测定结果基本与其一致。

4 结论

试验建立了UPLC同时测定人参类保健食品中13种人参皂苷含量的方法。该方法对13种人参皂苷有较好的分离度和柱效。经方法学验证，该方法具有较好的线性、回收率和精密度，可测定西洋参保健食品中13种人参皂苷。应用该方法测定5批样品，根据测定结果，以皂苷总量、Rb1/Rg1的比例和Rf为指标评价样品品质，5批样品中有2批可能含西洋参根，2批为西洋参茎叶。