基于液相色谱-质谱联用及19F核磁成像技术测定一种新型氟类化合物

何芳菲 黄平升 王 婷 王东亮 王昱青*

(1.国家纳米科学中心，北京 100090；2.中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津 300192)

19F原子是一种拥有100%自然丰度的原子，磁敏感率约为1H原子的83%，在动物体内含量很少(大部分存在于牙齿及骨骼中)，因此，19F原子几乎不会受到背景噪声干扰，非常适合应用于核磁成像[1]。鉴于这些优势，国内外都在积极开发基于19F各种类型的MRI探针，用于体外和体内的生物学和病理学方面的诊断和治疗[2]，如拥有稳定C-F键的全氟化碳类探针、血管或肿瘤组织靶向19F探针、刺激反应性19F探针、具有酶活性的19F探针等，这些探针都是以19F原子为核磁成像核[2-5]。本团队新合成了一种19F核磁成像基团：N-(2-甲基丙烯酸乙酯)-N-(3,3,3-三氟丙基)-N-甲基甘氨酸(CBF3)，其溶解状态下的分子式为C12H19F3NO4+，分子量为298.1[6]。

CBF3具有超亲水性、分子量小、单分子含氟原子数量较高等优良特点[6]。通过19F进动频段利用19F核磁成像技术可以直接对CBF3进行成像[6]。19F核磁成像依赖于CBF3的单位浓度，由于该化合物为单分子结构，每个分子携带3个氟原子，因此当组织中CBF3的浓度达到一定高度后，采用19F核磁成像方法能够获得特异性良好的CBF3生物分布，并计算出不同脏器组织中CBF3的体积含量。

但小分子CBF3在小鼠体内代谢较快，19F核磁成像只能显示出该化合物在浓度含量较高组织的成像分布结果，而血液中CBF3的浓度达不到核磁成像检测限，无法通过成像方法对CBF3的血药浓度进行定性及定量分析。因此，还需要建立一套可靠的CBF3血药浓度的检测方法，以获得关于该物质的更多药物代谢信息。液相色谱-质谱联用技术能够将对小分子化合物进行快速精确的检测，且对于微量检测有很高的灵敏度[7]，因此非常适用于定量分析血清中低浓度的CBF3。通过超高效液相色谱可将目标组分从复杂的血清萃取液中快速、有效分离，多离子扫描模式(MRM)可对碎片离子进行特定筛选，从而对目标化合物进行准确的定性、定量分析[7,8]。因此，本研究利用液相色谱-质谱联用技术，建立了CBF3在小鼠血清萃取液中的色谱、质谱分析条件和标准曲线，并进行提取回收率、精密度等方法验证工作。此外，通过给药后5个不同时间点的19F核磁成像结果及液质定量分析结果，对CBF3在小鼠体内主要代谢分布的脏器及血药浓度进行了研究与探索。

1 材料与方法

1.1 材料

CBF3由中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所提供，分子式为C12H19F3NO4，结构式如图1。

图1 CBF3的分子结构式

1.2 试剂与仪器

乙腈(LC-MS级，美国Fisher公司)；甲酸(上海Aladdin试剂公司)；双蒸水(香港屈臣氏集团有限公司)；LCMS-8050液相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)；BioSpec70/20USR小动物核磁共振成像仪(德国Bruker公司)；Allegra 64R 离心机(美国BeckmanCoulter公司)；涡旋混合器(国产)；微孔滤膜(0.22μm，天津Agela公司)。

1.3 溶液配制

CBF3储备液：精确称量1mg CBF3标准品粉末，双蒸水定容于100mL容量瓶中，0.22μm滤膜过滤，于4℃保存，备用。

空白基质：EP管取适量健康小鼠血清，加入4倍体积乙腈，涡旋1min充分混匀，4℃离心10分钟，4000r/min，取上清，0.22μm滤膜过滤，双蒸水稀释100倍，备用。

标准工作溶液：准确移取适量上述储备液，用空白基质稀释，分别配制成 10、50、100、200、500、1000μg/L的CBF3溶液，混匀备用。

质控样品：将上述CBF3储备液用空白基质稀释成相应浓度，配成质控品。质控样品包括低浓度(20μg/L)、中浓度(200μg/L)、高浓度(400μg/L)。

1.4 实验条件

色谱分离条件：InertSustainBio C18 HP色谱柱(2.1×150mm，3μm，岛津公司)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱；洗脱程序0.01～5min，30%～90% B；5～6min，90% B；6.01～8min，30% B；流速0.2ml/min；进样体积1μL，运行时间8min。

电喷雾质谱条件(ESI-MS)：雾化气流量：3L/min；接口温度：300℃；DL温度250℃，干燥气流量10L/min。检测模式：正离子扫描模式、多重反应监测(MRM)。离子对选择及电压优化结果见表1。

表1 CBF3的离子对选择、碎片离子结构与电压优化

1.5 CBF3血药浓度检测

健康Balb/c小鼠5只，体重均为15g，3%戊巴比妥腹腔注射麻醉。CBF3粉末配制为100mg/mL的注射液100μL，尾静脉注射入小鼠体内，分别于15min、30min、45min、90min、120min取血，非抗凝全血静置1h，4℃离心8分钟，3000r/min，取上清。

蛋白沉淀处理：100μL血清加入400μL乙腈，涡旋混匀2min，4℃离心10分钟，4000r/min，双蒸水稀释100倍，0.22μm 滤膜过滤，LC-MS分析。

1.6 CBF3活体19F核磁成像

健康Balb/c小鼠1只，体重为15g，3%戊巴比妥腹腔注射麻醉。CBF3粉末配制为100mg/mL的注射液100μL，尾静脉注入小鼠体内，放入19F/1H双频鸟笼线圈中，选用SE序列在注射后15min、30min、60min、90min、120min时间点对小鼠进行活19F核磁成像，检测CBF3的体内分布。成像参数如下：TE/TR = 1.88/3000 ms，FA = 90°，FOV = 50×50 mm，MTX = 100×100， slice thickness = 4 mm，slice number = 4，NEX = 10。1H背景选用SE序列，参数如下：TE/TR = 5.97/300 ms，FA = 90°，FOV = 50×50 mm，MTX = 256×256，slice thickness=1mm，slice number=16，NEX=2。

肝脏、肾脏和膀胱的CBF3时间-体积分布计算方法如下：选取活体成像时背景噪声的平均SI为阈值，计算脏器内高于阈值的体素点数量(voxel number)，然后乘以每个体素大小(voxel size=1mm3)，即可得到脏器内高于阈值的CBF3体积。

2 结果与讨论

2.1 CBF3液相色谱-质谱检测结果

2.1.1标准曲线、线性范围及定量下限

选择离子对298.1>113.1建立标准曲线，取1.3中配制的标准工作溶液进行LC-MS/MS在线分析，以CBF3峰面积为纵坐标，CBF3浓度为横坐标，进行线性拟合和定量分析。结果表明在10-1000μg/L浓度范围内，CBF3峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程为f(x)=48539.3×x+177818，相关系数(R)为0.995，定量下限为10μg/L。

2.1.2精密度与提取回收率

采用低、中、高3个不同浓度的质控样品，分别连续进样5次，进样浓度由低到高，测定对应峰面积的标准偏差为日内精密度2.61%～5.04%。将3个浓度的质控样品连续3日进行检测，获得日间精密度1.95%～8.58%。取CBF3储备液加入小鼠血清，经过上述蛋白沉淀处理，加入空白基质稀释，配成低浓度(20μg/L)、中浓度(200μg/L)、高浓度(400μg/L)3个浓度，与对应的质控样品进行比较，得到的提取回收率在100.66%～103.63%(表1)，本实验中样品的提取方法对样品定量检测影响较小。

表2 低、中、高浓度组的CBF3精密度和提取回收率

2.1.3血药浓度检测结果

药物注射小鼠后15min、30min、45min、90min、120min即时采血，采用1.5中所述方法处理样品，液相色谱-质谱方法检测，采用多重反应监测(MRM)模式和正离子扫描模式测得CBF3分子量为298.1，出峰时间2.71min，图谱如图2所示。定量检测上述5个时间点样品中CBF3的浓度，依次为282.2μg/L、162.26μg/L、68.3μg/L、20.9μg/L、13.5μg/L。

图2 药物注射后CBF3样品的MRM色谱图(A1-A5)和正离子扫描质谱图(B1-B5)

2.2 19F核磁成像结果

药物注射一段时间内，采用19F核磁成像技术能够清晰地采集到CBF3在小鼠肝脏、肾脏和膀胱中的成像信号，说明该化合物具有比较稳定的成像性能，同时通过CBF3时间-体积分布计算，发现该化合物在小鼠体内扩散较快，一部分CBF3通过肝脏代谢，绝大部分经过肾脏代谢，随尿液大量蓄积在膀胱中，最终通过尿液排出体外。图3为小鼠肝脏CBF3成像结果，从15min到60min，高于阈值的CBF3体积增加，CBF3在肝脏内累积；从60min到120min，CBF3在肝脏内含量下降。图4为小鼠肾脏CBF3成像结果，从15min到30min，高于阈值的CBF3体积增加，CBF3在肾脏中的含量增加；从30min到120min，肾脏内CBF3体积没有明显变化趋势。图5为小鼠膀胱CBF3成像结果，从15min到120min，高于阈值的CBF3体积明显增加，CBF3随尿液在膀胱内迅速累积。

图3 小鼠肝脏中CBF3 的19F核磁成像信号强度图和分布体积折线图

图4 小鼠肾脏中CBF3 的19F核磁成像信号强度图和分布体积折线图

图5 小鼠膀胱中CBF3 的19F核磁成像信号强度图和分布体积折线图

3 结论

本研究建立了一种快速、灵敏、便捷的方法定量检测CBF3的血药浓度，通过该方法测得CBF3的血药浓度在小鼠尾静脉给药45分钟后迅速下降，在90分钟后基本代谢完全。同时，还建立了一种直观、清晰的19F核磁成像方法以检测CBF3在小鼠肝、肾和膀胱的代谢情况。液相色谱-质谱联用检测技术和19F核磁成像技术相结合能够对CBF3这类小分子氟化物进行全面有效的检测，其中核磁成像方法适用于高浓度CBF3全身分布的定性研究，液相色谱-质谱联用法可以检测到核磁成像检出限以下的血液药物浓度情况，两种方法互补有助于共同阐释该类氟化物进入动物体内的代谢分布。在未来进一步研究中，我们将完善以CBF3为核心的19F核磁探针，通过多分子聚合或连接靶向多肽等方法，适当增加其在体内的驻留时间及靶向性，并进一步开发适合的检测方法。