非酒精性脂肪性肝纤维化动物模型的改良和建立

周玉平，温晋锋，周飞，王庆领，杨萍，吕雪幼

（1.宁波大学医学院附属医院 消化内科，浙江 宁波 315020；2.宁波大学 消化疾病研究所，浙江宁波 315020；3.宁波大学医学院 生物化学与分子生物学研究所，浙江 宁波 315211；4.宁波卫生职业技术学院 护理学院，浙江 宁波 315100）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已经成为全球最主要的慢性肝病[1]。NAFLD长期发展的结果必将导致非酒精性脂肪性肝纤维化（hepatic non-alcoholic steatofibrosis，NASF）[2]。系统评价和Meta分析显示，肝纤维化是NAFLD死亡率的最重要预测因素，与无纤维化相比，有纤维化的NAFLD患者的全因死亡风险增加，并且该风险随着纤维化阶段的增加而增加[3]。由此可见，NASF是NAFLD进展过程中的关键环节，也是导致其不良结局的重要原因。因此，进一步研究NASF的发病机制及探索防治NASF的有效药物是当前的重大课题，但目前尚无理想的NASF动物模型制约了相关的基础研究。本研究旨在构建一个造模时间相对较短、成功率高、重复性好的动物模型，使之能够较完整表达人类NASF的病理特点和发病机制特点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：6～8周龄SFP级C57BL/6J雄性小鼠，体质量（22±4）g，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008。动物饲养于宁波大学实验动物中心，本研究获得宁波大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 药物与试剂：CCl4分析纯购自上海国药集团化学试剂有限公司；蛋氨酸-胆碱缺乏饲料（methionine-choline-deficient diet，MCD，批号TP3005G）及对照饲料（methionine-cholinesupplemented diet，MCS，批号TP3005Gs）购自南通特洛菲饲料科技有限公司；伊红、苏木精、苯胺蓝均为美国Sigma公司产品；谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、甘油三酯（triglyceride，TG）生化检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗体购自美国Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和造模：适应性喂养5 d后，小鼠随机分成正常组、模型组，正常组8只，模型组16只。正常组给予MCS饲料喂养；模型组采用MCD饮食诱导+每周1次腹腔注射10% CCl4-橄榄油溶液（剂量为2 mL/kg），分4周组和6周组，各8只。

1.2.2 一般指标观察：每天观察小鼠的一般状况，包括自主活动、精神状态、毛发变化等，每周固定时间称量体质量，最后处死动物后，摘取肝脏滤纸吸干表面水分称量其湿重，计算肝脏指数（%）=肝湿重/体质量×100%。

1.2.3 标本留取方法：4周末取4周组、6周末取对照组和6周组小鼠进行指标检测，动物禁食12 h，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，打开腹腔，下腔静脉采血，摘取肝脏，选肝脏最大叶1块置于4%中性甲醛溶液中固定，用于组织病理染色及免疫组化检测；另取一较大叶切成方形，OTC包埋后液氮速冻用于冰冻切片；其余EP管分装液氮速冻后转移到-70 ℃保存。

1.2.4 生化指标检测：ALT、AST、TBIL活性检测及血清、肝脏TG含量检测均采用生化检测试剂盒进行。

1.2.5 组织病理学观察：制作肝组织石蜡切片，行HE染色和Masson染色，观察组织炎症、脂肪变性和胶原增生情况。制作肝组织冰冻切片，行油红O染色，观察脂滴沉积情况。用Image-Pro Plus 6.0软件测量各个样本的阳性染色面积，每个样本测量5个视野，计算出每张切片的平均阳性面积（μm2）用于统计分析。

1.2.6 免疫组织化学检测α-SMA表达：常规制作石蜡切片后二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水；3% H2O2阻断、灭活内源性过氧化物酶；PBS冲洗后0.01 mol/L枸橼酸缓冲液进行抗原修复；滴加一抗（α-SMA，稀释500倍）；4 ℃冰箱孵育过夜；室温平衡及PBS冲洗；滴加二抗37 ℃孵育30 min；DAB反应染色；苏木素复染、干燥、封片；显微镜下观察拍照，每张切片随机选择5不同的视野观察拍照，并用Image-Pro Plus软件测量阳性染色面积，每个样本测量5个视野，计算出每张切片的平均阳性面积（μm2）用于统计分析。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件进行分析。正态分布计量数据以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，2组间进一步比较采用LSD检验，若不服从方差齐性，则采用Dunnett-T3检验法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后小鼠一般状况和体质量变化 对照组小鼠生活状态良好，毛发光泽；模型组小鼠随造模时间延长，皮毛变得疏松油腻，精神萎靡，日渐消瘦。对照组小鼠体质量随时间延长稍有增加，但趋于稳定；模型组则明显有下降趋势，尤其在第2、第5周下降最为明显，自第2周开始模型组小鼠体质量显著低于对照组（P＜0.01），见表1。

表1 各组小鼠体质量变化比较（每组n=8，±s，g）

表1 各组小鼠体质量变化比较（每组n=8，±s，g）

组别 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周对照组 25.06±0.91 25.31±0.72 25.54±0.98 27.11±0.15 26.70±0.95 27.88±1.17模型组 24.50±1.15 21.60±1.20 21.05±0.79 20.46±2.79 16.96±1.83 14.89±1.79 t 1.083 7.487 10.080 6.238 13.371 17.153 P 0.297 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 造模后小鼠的肝脏变化及肝指数情况 造模后的小鼠肝脏可见表面光泽差，颜色偏黄白，有明显脂肪变性，6周模型小鼠更为明显，且部分肝脏可见米粒大小的结节，而对照组小鼠肝脏表面光滑，色泽粉红，无结节，无脂肪变性（见图1）。计算肝脏指数结果显示，造模6周后肝脏指数明显上升，显著高于对照组（P＜0.01），见表2。

图1 各组小鼠肝脏外观比较

表2 各组小鼠肝脏指数比较（每组n=8，±s）

表2 各组小鼠肝脏指数比较（每组n=8，±s）

与对照组比：aP＜0.01；与4周模型组比：bP＜0.01

组别 肝湿重（g） 肝脏指数（%）对照组 1.02±0.07 3.84±0.214周模型组 0.62±0.02a 3.40±0.066周模型组 0.62±0.07a 4.73±0.38ab F 45.879 21.200 P＜0.001 0.002

2.3 各组小鼠血清ALT、AST、TBIL活性比较 生化检测结果显示，相比正常组，模型组血清ALT、AST、TBIL指标均显著升高（P＜0.01）；6周模型组指标升高更为明显，较4周模型组显著升高（P＜0.01），见表3。

表3 各组血清肝功能指标比较（每组n=8，±s）

表3 各组血清肝功能指标比较（每组n=8，±s）

与对照组比：aP＜0.01；与4周模型组比：bP＜0.01

组别 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L）对照组 23.50± 4.78 153.75± 36.86 2.64±0.554周模型组 182.00±16.10a 243.25± 23.08a 5.73±0.99a 6周模型组 535.38±66.71ab 766.25±159.10ab 9.58±3.44ab F 58.702 96.555 22.087 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各组小鼠血清和肝脏TG含量比较 生化检测结果显示，相比对照组，模型组血清TG含量显著下降（P＜0.01），而肝脏TG含量显著升高（P＜0.01）；其中，6周模型组血清TG含量显著低于4周模型组（P＜0.01），6周模型肝脏TG含量显著高于4周模型组（P＜0.01），见表4。

表4 各组血清和肝脏TG含量比较（每组n=8，±s，U/L）

表4 各组血清和肝脏TG含量比较（每组n=8，±s，U/L）

与对照组比：aP＜0.01；与4周模型组比：bP＜0.01

组别 血清TG 肝脏TG对照组 1.26±0.15 188.48±22.324周模型组 1.07±0.07a 377.27±17.56a 6周模型组 0.69±0.06ab 626.10±53.19ab F 54.400 175.806 P＜0.001 ＜0.001

2.5 各组小鼠肝组织病理变化比较 HE染色、油红O染色及Masson染色显示，对照组肝组织形态结构正常，汇管区无炎症细胞浸润；无脂肪变性，无红色脂滴；只在血管壁可见少量胶原染色。模型组肝组织可见汇管区炎症细胞浸润；大量脂肪变性，胞质内充满大小较一致的脂滴；胶原沉积明显增加，窦周可见胶原纤维形成细丝状甚至粗索状分布，肝小叶结构紊乱，也可见纤维组织增生；其中6周模型的病理改变较4周模型明显加重，见图2。半定量分析显示，模型组的脂滴和胶原面积显著高于对照组（P＜0.05）；6周模型组显著高于4周模型组（P＜0.05），见表5。

表5 各组肝组织病理染色阳性面积比较（每n=8，±s，μm2）

表5 各组肝组织病理染色阳性面积比较（每n=8，±s，μm2）

与对照组比：aP＜0.01；与4周模型组比：bP＜0.05

组别 油红O染色 Masson染色 α-SMA蛋白表达对照组 758.4± 125.7 2827.7± 453.7 425.6± 37.94周模型组 71709.7± 9273.9a 26536.4±3039.7a 2233.9± 77.8a 6周模型组 119173.0±15862.9ab 35614.1±6394.8ab 2988.8±161.1ab F 94.663 102.471 470.323 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

图2 各组小鼠肝脏组织病理学改变比较

2.6 各组小鼠肝组织α-SMA蛋白表达比较 免疫组织化学染色检测α-SMA蛋白表达结果显示：对照组肝组织见少量α-SMA表达在血管壁；模型组肝组织α-SMA阳性染色明显增多，主要见于汇管区，肝血窦和纤维间隔；其中6周模型的阳性表达较4周模型明显增加。见图3。染色阳性面积的半定量分析显示，模型组阳性表达面积显著高于对照组（P＜0.01）；6周模型组又显著高于4周模型组（P＜0.01），见表5。

图3 各组小鼠肝组织α-SMA蛋白免疫组织化学染色（×100）

3 讨论

NASF的基础研究及新药开发是肝病研究领域的热点和难点，研制理想的动物模型是当前需要迫切解决的问题。NAFLD模型较为成熟，其中高脂饮食、MCD饮食诱导的模型应用最为广泛[4]。虽然NAFLD模型研究取得了较大进展，然而，构建由单纯性脂肪肝过渡到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatchepatitis，NASH）再到肝纤维化肝硬化这样反映NAFLD全病程的动物模型的方法并不多见。虽然高脂饮食和MCD饮食诱导的模型能较好地模拟NASH的病理特点，但较难出现纤维化和肝硬化改变。NASF模型复制较为困难，一定程度上制约了相关的基础和药物开发研究。

有研究者将MCD饮食喂养时间延长至8周，以期复制简易可靠的NASF模型，结果虽然小鼠肝脏出现严重的脂肪变性，但Masson染色结果提示肝纤维化仅为1-2级[5]。刘洋等[6]的6周MCD小鼠模型发现，虽然MCD组小鼠肝组织中α-SMA、COL1A1、TGF-β1等纤维化相关的mRNA表达显著升高，但组织病理学检测仍未见明显的肝纤维化改变。虽然胆碱缺乏并添加乙硫氨酸饮食模型可复制NASF病理过程，短期喂食可使动物肝脏发生脂肪变性、炎症，长期喂食则可使动物肝脏发生纤维化、硬化甚至肝癌，但此方法的缺点是动物体质量下降超过20%，死亡率非常高，大大增加实验的难度，并降低了可重复性。盖曲倞等[7]对该模型经过改良大大降低了死亡率，成功建立小鼠NASH及肝纤维化的模型，但造模时间需要16周。高脂饮食诱导的大鼠模型出现肝纤维化，造模时间则更久，一般需要24周以上[8-9]。TSUCHIDA等[10]报道了一种可迅速进展为肝纤维化和肝癌的NASH小鼠模型，研究者给予C57BL/6J小鼠富含高脂、高糖和高胆固醇的饮食，结合每周在腹腔内给予低剂量的促进剂CCl4，建立了一种具有快速广泛纤维化和肝细胞癌进展的NASH小鼠模型，在12周可产生第3阶段纤维化，并且在24周发展成肝癌，该模型12周可出现明显肝纤维化改变，且动物死亡率低，是目前较为理想的模型，但造模时间仍相对较长，且高糖、高脂、高胆固醇的饮食不符合我国的饮食特点。

可见目前NASF动物模型存在病理改变不明显、造模周期长、动物死亡率高、重复性差等问题，有必要进一步改良或研制新的模型。本课题组在大量文献调研基础上提出了一种新的造模方案：即在常规MCD饮食诱导的基础上，反复给予低剂量的CCl4的腹腔注射，结果显示，该方法6周能较好模拟NASF病理表现，出现严重脂肪变、肝脏炎症及明显的肝纤维化改变（分级为3～4级），肝纤维化形成关键细胞即星状细胞活化的标志物α-SMA的表达也显著增多，血清肝功能明显异常，肝脏脂肪含量显著增多且无动物死亡情况。需要指出的是，此种模型与大部分NAFLD患者存在代谢综合征的表型有所差异，我们观察到小鼠摄入MCD后，摄食量有所减少，体质量逐渐下降，且血脂水平显著降低，这是本模型的不足之处。

MCD饮食诱发的C57BL/6J小鼠模型的造模原理是通过饮食中蛋氨酸与胆碱的缺乏造成线粒体β-氧化功能障碍和极低密度脂蛋白合成与分泌减少，从而使TG在肝细胞内迅速大量堆积，导致肝细胞脂肪变性，造成“第一次打击”[11]；进而，由于肝细胞的脂肪变性，线粒体减少对游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）的摄入，促使FFA的β-氧化增加，导致ROS的合成和脂质过氧化反应，形成对肝脏的“第二次打击”，最终导致NASH的发生[12]。CCl4具有肝毒性，进入机体后在肝内产生活化氧自由基，过氧化作用增强，加快肝脂肪变性进程，损伤肝细胞，造成肝细胞变性坏死，引起细胞外基质过度沉积而成肝纤维化，其代谢产物还可以刺激肝脏枯否细胞，释放促炎性细胞因子，进一步加重肝脏的损伤。CCl4诱导的化学肝损伤是经典的肝纤维化模型，但其发病机制、病程演变过程和组织形态的改变都与人类脂肪肝差异较大，高浓度CCl4造模药物毒性强，肝细胞坏死、炎症和纤维化发生早而严重，动物死亡率高[13]。本研究联合MCD饮食和反复的低剂量注射CCl4，扬长避短，成功复制了NASF模型，符合人类NASF的发病机制和病理表现特点，可用于临床药效评价和新药研究。