丛枝菌根真菌对太白贝母生长及质量标志物的影响

张建海，冯彬彬，吴翠色

1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120；2.重庆市神女药业股份有限公司，重庆 404700

丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌在自然界分布广泛，并能与80%以上被子植物根系建立良好的共生体系，改善宿主植物水分和营养状况，提高植物抗逆性，影响次生代谢活动，具有促进宿主植物生长、提高产量和改善品质作用。我国药用植物资源十分丰富，近年来，将AM 真菌作为菌剂使用已成为提高栽培药用植物产量和品质、稳定其药效与药源的新途径[1-3]。太白贝母Fritillaria TaipaiensisP. Y. Li为2015 年版《中华人民共和国药典》（一部）川贝母的基源植物之一[4]。目前川贝母类药材资源匮乏，而太白贝母是人工栽培成功的极少数川贝母品种之一，具有很高的药用研究价值[5-6]。本研究通过盆栽接种试验，研究4 种AM 真菌对太白贝母生长的生理生化影响，探讨太白贝母质量标志物含量与AM 真菌侵染之间的关系，为提高人工栽培药用植物质量标志物含量、揭示中药材道地性的形成机理，以及创新药用植物人工栽培技术提供试验依据。

1 仪器与试药

Agilent1260 智能柱温箱、VWD 紫外检测器，美国安捷伦公司；KQ5200E 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；BSA224S 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DGX-9143B-1 型数显鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司；HH.SYZ1-NI 型电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司；SHB-IV双A 循环式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；LI-6400 便携式光合作用测定仪，北京力高泰科技有限公司；1860PC 紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司；SG-5404A 磁力搅拌器，上海硕光电子科技有限公司；SZ51 奥林巴斯显微镜，上海普赫光电科技有限公司； Millipore 纯水系统。

地表球囊霉Glomus versiforme（GV）、聚丛球囊霉Glomus aggregatum（GA）、摩西球囊霉Glomus mosseae（GM）、缩球囊霉Glomus constrictum（GC1），购自北京市农林科学院植物营养与资源研究所中国AM 真菌种质资源库；太白贝母，产自重庆巫山笃坪镇重庆神女药业股份有限公司种植基地，由重庆三峡医药高等专科学校付绍智教授鉴定为百合科贝母属太白贝母Fritillaria TaipaiensisP. Y. Li。西贝母碱苷、贝母碱甲、贝母碱乙、贝母辛对照品，中国食品药品检定研究院，批号分别为111917-201202、110750-201612、110751-201712、111892-201402；磷酸、甲醇、乙腈为色谱纯，石油醚、三氯甲烷、甲醇为分析纯，实验用水为超纯水；KH2PO4，牛血清蛋白，30%过氧化氢。

2 方法

2.1 接种

取田间耕作层土壤，风干过筛，在高压灭菌锅中灭菌1.5 h。采用室温盆栽方法，分为接种GV、GA、GM、GC1 和不接种（对照）5 个处理，每个处理重复3 次，每盆装土5 kg，每千克土壤分别加氮肥（硫酸铵）、磷肥（磷酸二氢钾）、钾肥（硫酸钾）各0.1、0.15、0.15 g 作底肥。每盆选择大小一致的太白贝母鳞茎10 株定植，每盆层施AM 真菌50 g，对照组不加任何真菌，所有处理于生长期间施有机肥1 次，于太白贝母种植基地温室大棚培养，定期管理。所取材料带回实验室进行处理，备用。

2.2 指标检测

2.2.1 侵染率将采集的太白贝母根系用水冲洗干净，剪成l cm根段，采用Phillips 和Hayman 方法（即KOH 透明-乳酸甘油曲利本兰染色法）测定AM 真菌侵染率。将太白贝母根系置于10%KOH 溶液中，90 ℃水浴处理45 min，弃去KOH，用自来水冲洗干净，置于1%HCl中酸化，再将植物根系移至乳酸甘油曲利本兰染液中，90 ℃水浴染色15 min。于显微解剖镜20×40 倍镜下采用十字交叉法测定太白贝母根系的AM 真菌侵染率[7]。

2.2.2 生物量于太白贝母生长期开花前叶片完全伸展后，利用直尺测定叶片的长度和宽度；开花期测定地上部分的鲜重和干重；地上部分枯萎后挖取鳞茎，测定鳞茎的鲜重和干重，并计算折干率。折干率（%）＝干重÷鲜重×100%。

2.2.3 叶片光合指标在太白贝母生长旺盛期每日10:00 左右，用LI-6400 便携式光合作用测定仪，选用人工光源测定叶片净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和胞间CO2浓度（Ci）[8]。

2.2.4 叶片生化指标

取0.5 g 鲜叶片，加入8 mL 磷酸缓冲液，于冰浴中研磨，匀浆转入离心管，于4 ℃、8000 r/min 离心10 min，上清液用于保护酶系统测定。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性分别采用氮蓝四唑（NBT）光化学还原法（以抑制NBT 降解50%作为1 个酶活单位）、愈创木酚比色法（以l min 光密度值变化0.01 作为1 个酶活单位）和紫外吸收法（以光密度值变化0.01 作为1 个酶活单位）测定[8]。可溶性糖含量用蒽酮比色法测定，可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-250 染色法测定。

2.2.5 质量标志物采用周浓等[9-11]测定方法，将太白贝母干燥鳞茎粉碎，取样品粉末3.0 g，置250 mL 圆底烧瓶中，加150 mL 石油醚（30～60 ℃）浸泡12 h 进行脱脂处理，过滤，滤渣水浴挥干后加质量分数28%浓氨试液10 mL，浸润2 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液150 mL，混匀，置70 ℃水浴中加热回流3 h，放冷，过滤，回收滤液至干，残渣加甲醇溶解并定容至2 mL量瓶中，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，HPLC 测定不同处理太白贝母中总生物碱、贝母辛、西贝母碱苷、贝母碱甲、贝母碱乙含量。色谱条件:采用Agilent Extend-C18色谱柱（4.0 mm×250 mm，5 μm），以0.03%二乙胺水-甲醇为流动相梯度洗脱，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL。

2.3 统计学方法

采用SPSS22.0 统计软件进行分析。数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 丛枝菌根真菌对太白贝母的侵染率

不同处理太白贝母的AM 真菌侵染率见图1。可以看出，不同AM 真菌均能显著提高太白贝母侵染率（P＜0.05），且不同AM 真菌对太白贝母根系的侵染能力有所不同，GA 对太白贝母的侵染率显著高于其他3 种AM 真菌。同时，对照组也有一定侵染率，说明太白贝母栽种前根系已被少量AM 真菌侵染。

图1 不同处理太白贝母的AM 真菌侵染率比较

3.2 丛枝菌根真菌对太白贝母生物量的影响

太白贝母生物量指标测定结果见表1。可以看出，与对照比较，不同处理的太白贝母鳞茎鲜重和干重均显著增加（P＜0.05），其中接种GA 鳞茎鲜重和干重增加最多，分别比对照高49.52%和77.82%，接种GV鲜重和干重增加最少，分别比对照高 31.59%和47.28%；不同处理的太白贝母鳞茎折干率与对照比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照比较，不同处理的太白太母地上部分鲜重和干重均显著增加（P＜0.05），其中接种GA 地上部分鲜重和干重增加最多，分别比对照高66.15%和76.45%；接种GC1 鲜重和干重增加最少，分别比对照高42.10%和49.42%；不同处理的太白贝母地上部分折干率与对照比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同处理的太白贝母叶长和叶宽均高于对照，其中GA 处理增加较多，GC1 处理增加较少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 不同处理太白贝母生物量比较（—x±s，n＝3）

3.3 丛枝菌根真菌对太白贝母光合特性的影响

不同处理的太白贝母叶片光合指标测定结果见图2。与对照比较，接种GV、GA、GM、GC1 均能显著提高叶片净光合速率（P＜0.05），分别比对照提高15.11%、55.14%、30.74%、24.92%，其中接种GA最高；气孔导度与对照比较均显著增加（P＜0.05），分别提高36.32%、59.20%、29.01%、41.75%，其中接种GA 最高；蒸腾速率与对照比较均不同程度增加，分别提高21.42%、29.59%、11.22%、10.20%，接种GV、GA 差异有统计学意义（P＜0.05），其中接种GA 增加最多；胞间CO2浓度与对照比较均不同程度增加，分别提高5.84%、24.81%、16.35%、10.75%，接种GA、GM、GC1 差异有统计学意义（P＜0.05），其中接种GA 增加最多。

图2 不同处理太白贝母叶片光合指标比较（—x±s，n＝3）

3.4 丛枝菌根真菌对太白贝母叶片生理特性的影响

不同处理的太白贝母叶片生化指标测定结果见图3、图4。不同处理均可显著提高叶片CAT、SOD、POD 活性（P＜0.05）。CAT 活性以接种GA 最高，为110.25 U/（g·min）；接种GM 最低，为89.14 U/（g·min）。SOD 活性以接种GA 最高，为122.14 U/（g·FW），接种GC1 最低，为117.16 U/（g·FW）；POD 活性以接种GA 最高，为95.12 U/（g·min），接种GC1 最低，为88.21 U/（g·min）。接种GV、GA、GM、GC1 后叶片可溶性蛋白含量显著高于对照（P＜0.05），分别提高21.06%、26.76%、16.29%、20.36%，其中GA最高，GM 最低；可溶性糖含量均高于对照，分别提高20.44%、21.73%、15.65%、2.56%，接种GV、GA、GM 差异有统计学意义（P＜0.05），其中GA 最高。

图3 不同处理太白贝母保护酶系统比较（—x±s，n＝3）

图4 不同处理太白贝母可溶性糖和可溶性蛋白含量比较（—x±s，n＝3）

3.5 丛枝菌根真菌对太白贝母质量的影响

不同处理太白贝母质量标志物含量测定结果见表2。不同处理均可提高太白贝母总生物碱、贝母辛、西贝母碱苷、贝母碱甲、贝母碱乙含量（P＜0.05）。接种GV、GA、GM、GC1 后太白贝母总生物碱含量分别比对照提高35.94%、40.21%、32.03%、30.60%；贝母辛含量分别比对照提高 40.91%、41.67%、26.52%、21.97%；西贝母碱苷含量分别比对照提高27.13%、17.83%、13.95%、19.83%；贝母碱甲含量分别比对照提高16.67%、23.33%、6.67%、3.33%；贝母碱乙含量分别比对照提高16.67%、25.00%、8.33%、16.67%。

表2 不同处理太白贝母质量标志物比较（—x±s，mg/g，n＝3）

4 讨论

AM 真菌生长发育呈“S”形曲线，开始时为滞缓期，侵染过程缓慢，随后快速侵染，达到高峰后持续侵染，与植物根系生长形成动态平衡。不同AM 真菌在太白贝母中的侵染情况有所不同，可能与其对寄主的选择性有一定关系，提示AM 菌剂在实际应用中需要考虑不同AM 真菌与植物之间的选择性。AM 真菌侵染太白贝母根系是一个复杂的生理过程，随着现代分子生物学技术的发展和菌根研究的深入，将进一步阐明其机制。

本试验结果显示，太白贝母能与AM 真菌形成良好共生关系，不同AM 真菌对太白贝母根系有不同程度的侵染，接种AM 真菌明显提高了菌根侵染率，从而提高太白贝母的生物量。4 种AM 真菌接种后积累干物质的量不尽相同，这可能是由不同菌种的特点决定的，也可能是土壤的理化性质对不同菌种产生的影响导致，有待于进一步观察。地下鳞茎干重与地上部分干重比值不同，会影响植物的生长状况，进而影响太白贝母的产量。本试验中，接种不同AM 真菌的太白贝母地下鳞茎干重与地上部分干重比值有所不同，接种GV、GM 者低于对照，而接种GA、GC1 者高于对照，表明接种不同AM 真菌对太白贝母地上部分和地下部分的生长影响不同，可为提高太白贝母产量提供试验依据。

净光合速率是叶片光合特性的重要指标，也是影响生物产量的重要因素，植物的生长与其光合性能之间存在着必然的关系。本研究结果表明，接种不同AM 真菌均能显著提高太白贝母叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度。接种AM 真菌后净光合速率的提高伴随着气孔导度、蒸腾速率和胞间CO2浓度的提高，提示AM 真菌处理导致太白贝母光合作用提高可能与气孔导度的提高有关，说明太白贝母光合作用增强是气孔因素造成的。

太白贝母叶片保护酶系统包括SOD、CAT和POD等，其中SOD 是植物细胞中重要的活性氧清除酶之一，CAT 和POD 能分解H2O2，减轻细胞损伤。三者相互协调，使活性氧自由基维持在较低水平，从而防止活性氧引起的膜脂过氧化及其他损害过程，保证植物正常生长。本试验中，接种AM 真菌使太白贝母SOD、POD 和CAT 活性均呈现明显增加趋势，说明AM 真菌能有效防止植株衰老，提高植株抗逆性。

可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量是衡量植物幼苗健壮程度常用的生理指标。接种AM 真菌后，太白贝母中可溶性糖和可溶性蛋白质含量均显著高于对照，表明接种AM 真菌可培育具有较强生理活性的太白贝母植株。

AM 真菌可能通过参与寄主植物代谢途径，影响次生代谢产物的产量[12-14]。太白贝母的质量标志物包括总生物碱、贝母辛、西贝母碱、贝母碱甲、贝母碱乙等，其主要质量标志物含量受产地、品种、生长阶段及环境因素的影响而存在一定差异。本试验发现，AM 真菌的侵染可明显影响太白贝母中总生物碱、贝母辛、西贝母碱苷、贝母碱甲、贝母碱乙的代谢，接种不同AM 真菌的太白贝母上述成分含量均高于对照，表明共生真菌是影响太白贝母质量标志物含量的重要因素之一。AM 真菌对质量标志物含量及其在药用植物体内累积分布规律影响的具体机制还有待进一步研究。