虎奶菇菌丝体提取物对肺癌细胞增殖的影响*

姚清国，单保恩

（1.石家庄学院化工学院，河北 石家庄 050035；2.河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050019）

虎奶菇 [Pleurotus tuber-regium(Fr.)Sing]又名虎奶菌、南洋茯苓，属于担子菌亚门（Basidiomycotia） 层菌纲 （Hymenomycetes） 伞菌目 （Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae） 侧耳属（Pleurotus），是一种珍贵食用菌，主要生长在非洲和东南亚，如尼日利亚、肯尼亚、马来西亚等国家，我国主要分布于云南、江西、广西等省[1]。虎奶菇富含蛋白质、多糖、矿物质和挥发油等成分，其细胞壁中含有高度分支的多糖和蛋白复合物，其水提多糖和碱提多糖均具有三螺旋构象，且均具有较强抗氧化活性[2-3]。虎奶菇提取物对雄性小鼠生殖功能有促进作用[4]；对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等为代表的革兰氏阳性细菌有较强的抑制作用[5]；能够降低小鼠的血糖含量、抗病毒[6]；可以通过激活巨噬细胞和相关酶来增强免疫系统，并诱导释放细胞因子[7]；对用四氯化碳处理后的小鼠肾脏有保护和恢复作用[8]；其胞外多糖对小鼠有降血糖和降血脂的作用[9]；Lin等[10]证实了虎奶菇菌核中乙醇提取物具有抗氧化和抗血管生成的活性；陶咏真等[11]利用水提法从虎奶菇菌核中提取高支化葡聚糖及其衍生物具有体外抑制肝癌细胞增殖的作用。

以往的研究大多数是对虎奶菇子实体和菌核的成分分析，对液体培养菌丝体的研究并不多。本研究主要采用液体培养技术，获得虎奶菇菌丝体，并对其分离提取，获得乙酸乙酯和正丁醇提取物，验证了其在体外抑制肺癌细胞增殖的作用。

1 材料与方法

1.1 菌种和菌株

虎奶菇菌种由河北省微生物制药工程技术中心保存；肺癌细胞（A549）由河北医科大学第四医院科研中心提供。

1.2 培养基及试剂

菌种斜面培养基为PDA培养基；液体培养主要成分为玉米粉、大豆饼粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾和硫酸镁，石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、甲醇和氯仿等化学试剂为国产分析纯；RPMI1640培养基购自苏州旭太生物工程有限公司，胎牛血清购自于浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜购自北京索莱宝科技有限公司，噻唑蓝（MTT）购自生工生物工程上海股份有限公司。

1.3 菌丝体培养条件的优化

1.3.1 大豆饼粉添加量对液体培养菌丝生物量影响

从保存的试管菌种中切取黄豆大小菌种块放入PDA平板中，25℃培养，5 d后转接到新PDA平板上继续培养，重复3次。然后沿菌落边缘切取8块0.5 cm×0.5 cm的菌丝块，放入250 mL三角瓶中培养。装液量为100 mL，培养基主要成分为玉米粉（20.0 g·L-1）、葡萄糖（15.0 g·L-1）、蛋白胨（2.0 g·L-1）、磷酸二氢钾（1.0 g·L-1）、硫酸镁（0.5 g·L-1），大豆饼粉添加量为 2 g·L-1、4 g·L-1、6 g·L-1、8 g·L-1、10 g·L-1、12 g·L-1、14 g·L-1、16 g·L-1、18 g·L-1共9组，每组做3个平行。摇床培养温度为25℃，摇床转速为120 r·min-1，培养结束后将培养液2 000 r·min-1离心5 min收集菌丝体，将菌丝体冷冻干燥，获得干燥的虎奶菇菌丝体。称重统计获得菌丝量。通过优化大豆饼粉的添加量获得较高的菌丝产量。

1.3.2 不同pH对虎奶菇液体培养菌丝生物量影响

采用优化后的液体培养基配方，调整培养基pH分别为 6.0、6.2、 6.4、 6.6、6.8、7.0、 7.2、 7.4、7.6，从活化好的虎奶菇PDA平板上，沿菌落边缘切取8块0.5 cm×0.5 cm的菌丝块，放入250 mL的三角瓶（装液量100 mL） 中培养，每组设置3个重复。在25℃、120 r·min-1条件下培养，培养结束后将培养液2 000 r·min-1离心5 min，收集菌丝体，将菌丝体冷冻干燥，称重。通过优化培养的pH来获得较高的菌丝产量。

1.3.3 培养时间对液体培养菌丝生物量的影响

从活化好的虎奶菇PDA平板，沿菌落边缘切取8块0.5 cm×0.5 cm的菌丝块，放入250 mL三角瓶（装液量100 mL） 中培养，共9组试验，每组3个平行，在25℃、120 r·min-1条件下培养，在120 h、132 h、144 h、156 h、168 h、180 h、192 h、 204 h、216 h各取出1组三角瓶，培养液 2 000 r·min-1离心5 min收集菌丝体，将菌丝体冷冻干燥，称重。通过优化培养时间来获得较高的菌丝产量。

1.4 菌丝体提取物的分离纯化

1.4.1 虎奶菇菌丝体乙酸乙酯提取物的分离纯化

将干燥的虎奶菇菌丝体1 000 g用粉碎机打成粉末，先用石油醚和乙醚浸提，浸提后的沉淀再用5倍体积的乙酸乙酯室温浸提24 h。将提取液与沉淀分离，乙酸乙酯提取液通过旋转蒸发仪进一步浓缩，然后通过硅胶柱纯化，用体积比为1∶2的氯仿和甲醇混合液洗脱，洗脱产物通过冷冻干燥称重，获得虎奶菇菌丝体乙酸乙酯提取物。

1.4.2 虎奶菇菌丝体正丁醇提取物的分离纯化

将上步骤中乙酸乙酯初步浸提后的沉淀在室温用正丁醇继续浸提24 h。正丁醇浸提液通过旋转蒸发仪进一步浓缩，然后通过硅胶柱纯化，用体积比为1∶1的氯仿和甲醇混合液洗脱，洗脱产物通过冷冻干燥称重，获得虎奶菇菌丝体正丁醇提取物。

1.5 菌丝体提取物对肺癌细胞生长的抑制试验

1） 复苏后的肺癌细胞（A549） 采用RPMI1640培养基（含有10%胎牛血清），置于37℃，5%CO2的二氧化碳培养箱中培养，用胰蛋白酶-EDTA消化对数期的细胞，离心收集。然后用新鲜培养基制成细胞悬液，再用血球计数板检测细胞浓度，使其达到约5×104mL-1；将细胞悬液轻轻混匀，向微孔板每孔中加入100 μL细胞，培养24 h后进行试验。

2）使用DMSO溶解虎奶菇乙酸乙酯提取物，加入微孔板的测试孔中，后用RPMI1640培养基进行稀释，使其浓度分别为800.00 μg·mL-1、400.00 μg·mL-1、200.00 μg·mL-1、100.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、0（培养基、MTT），另设置对照组（细胞、培养基、MTT）。每组3个重复，培养48 h后在显微镜下观察细胞的生长状态。

3）参照2）方法进行虎奶菇正丁醇提取物试验。

4） 采用MTT比色法测定各提取物对肺癌细胞增殖的影响[12]。在超净台中向微孔板每孔加入10 μL MTT溶液，放入培养箱中继续培养4 h～6 h，小心吸掉上清液，然后每孔加入150 μL的DMSO溶解结晶，之后放到微量震荡器上低速振荡10 min。待结晶充分溶解后，用酶标仪在492 nm波长处测OD值。OD值的大小可以反映活细胞的数量，从而间接反映虎奶菇乙酸乙酯提取物对肺癌细胞（A549） 增殖的影响。

2 结果与分析

2.1 虎奶菇菌丝培养条件的优化

虎奶菇菌丝体转接至PDA平板后，菌丝颜色浓白，气生菌丝密集，生长速度快，6 d左右长满平板。后接种于液体培养基进行摇瓶培养，液体培养基的主要成分为玉米粉、葡萄糖、大豆饼粉，酵母提取物，通过调整培养大豆饼粉含量优化培养基，得到最佳的培养条件，结果见图1。

由图1可知，大豆饼粉浓度从4 g·L-1开始，随着浓度的增加，培养获得的虎奶菇菌丝干重增加；在10 g·L-1时达到最大值，获得的菌丝干重为14.73 g·L-1；大豆饼粉浓度从12 g·L-1开始，获得的虎奶菇菌丝逐渐减少。因此，在培养中选取大豆饼粉10 g·L-1为最适的添加浓度。

采用优化后培养基配方，调整不同pH的培养基，进行培养条件的摸索，结果见图2。

由图2可知，培养基pH不同，其菌丝生长速率不同；从pH为6.0开始，随着pH上升，培养获得的菌丝逐渐增加；到pH为6.8时，培养获得菌丝含量达到最大，得到菌丝体干重为16.9 g·L-1，后随着pH的增加获得的菌丝干重逐渐下降。因此，最适合虎奶菇菌丝生长的pH为6.8，此时获得菌丝量最多。

培养时间对菌丝的重量也有影响，当培养时间短时，菌丝生长的比较少，培养时间过长时，菌丝会老化自溶，重量减少。采用摇瓶培养，从培养的第120小时开始统计获得的菌丝量，结果见图3。

由图3可知，从第120小时开始，随着培养时间的延长，菌丝的重量不断增加；在第168小时菌丝生长达到最大值，为17.5 g·L-1；此后随着时间的增加，菌丝的干重开始减少，可见通过摇瓶培养时，其中虎奶菇生长的最适的培养时间为168 h，即7 d，此时获得菌丝量最多。

2.2 提取物对肺癌细胞增殖的影响

对液体培养的虎奶菇菌丝体进行离心，获得湿菌丝体进行冷冻干燥，粉碎成粉末，然后分别用乙酸乙酯、正丁醇进行浸提。浸提的产物浓缩后通过硅胶柱层析进行纯化，纯化产物进行后续的药理学试验，统计不同浓度的虎奶菇乙酸乙酯和正丁醇提取物对肺癌细胞A549增殖的影响作用，结果见表1。

由表1可知，乙酸乙酯提取物在浓度为6.25 μg·mL-1时抑制率只有8.23%。此后随着浓度增加，对肺癌细胞的抑制率不断增加。当达到800 μg·mL-1时，对肺癌细胞增殖的抑制率达到84.51%，经计算其 IC50值为 252.62 μg·mL-1。正丁醇提取物在 6.25 μg·mL-1时对肺癌细胞增殖抑制率只有12.57%，此后随着浓度增加，对肺癌细胞的抑制率不断增加，当达到800 μg·mL-1时，对肺癌细胞的抑制率达到93.13%，经计算其 IC50值为 108.25 μg·mL-1。肺癌细胞在不同浓度提取物下的生长状态见图4（A、B为虎奶菇菌丝体乙酸乙酯提取物浓度为6.25 μg·mL-1和800.00 μg·mL-1时肺癌细胞A549的生长状态，C、D为虎奶菇菌丝体的正丁醇提取物浓度在6.25 μg·mL-1和 800 μg·mL-1时肺癌细胞 A549 的生长状态，E为空白对照）。

表1 虎奶菇菌丝体提取物对肺癌细胞A549增殖的影响Tab.1 Inhibitory effect of extract of Pleurotus tuber-regium mycelium on the growth of lung cancer cells A549

由图4 A可以看出，虎奶菇菌丝体乙酸乙酯提取物在浓度为6.25 μg·mL-1时对肺癌细胞A549的抑制作用较弱，细胞生长状态基本正常，随着提取物浓度的升高而抑制作用加强，如图4 B所示，在乙酸乙酯提取物浓度在800.00 μg·mL-1时，培养后的细胞排列松散，生长密度小，个别细胞形状不规则，说明该浓度下对肺癌细胞生长抑制作用比较强；如图4C所示，在虎奶菇菌丝体的正丁醇提取物浓度为6.25 μg·mL-1时，对肺癌细胞增殖的影响比较小，培养后的细胞排列紧密，生长密度较大，图4D所示，在正丁醇提取物在800.00 μg·mL-1时，对肺癌细胞增殖的抑制作用比较明显，培养后的细胞形状不规则、排列松散，生长密度小。图4E为对照组。通过以上试验可以推测虎奶菇菌丝体乙酸乙酯和正丁醇提取相中含有抑制肺癌细胞A549的活性成分。

3 结论与讨论

通过摇瓶培养试验得到虎奶菇优化的培养工艺，其中大豆饼粉的浓度为10 g·L-1，培养基的pH为6.8，培养时间为7 d，在此条件下菌丝干重为17.5 g·L-1；虎奶菇乙酸乙酯和正丁醇提取物浓度在6.25 μg·mL-1～800.00 μg·mL-1均对肺癌细胞 A549 有抑制作用，且抑制作用随浓度升高而不断增强，经计算乙酸乙酯和正丁醇提取物对肺癌细胞A549的抑制作用最强 （800.00 μg·mL-1），其 IC50值分别达到 252.62 μg·mL-1和108.25 μg·mL-1。

陶永真等[11]利用水提法从虎奶菇菌核中提取出一种高支化葡聚糖，将其硫酸酯衍生化，研究该多糖及其硫酸酯衍生物体外抗肝癌细胞株的活性，同时在小鼠体内的测试了抗肉瘤 S180活性，证明该多糖及其硫酸酯化衍生物能诱导人体肝癌细胞凋亡。近期研究发现，水溶性虎奶菇多糖对体外培养的人胃癌细胞SGC-7901增殖具有抑制作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡[13]。通过对以往研究的进一步拓展，采用液体培养获得虎奶菇菌丝体，将菌丝体提取物做抑制肺癌细胞生长的试验，发现乙酸乙酯和正丁醇提取物对肺癌细胞A549的增殖有一定的抑制作用，说明虎奶菇菌丝体中确实含有抑制肺癌细胞A549生长的有效成分，而其发挥功能的成分主要存在于乙酸乙酯和正丁醇提取分离物中，该结果为虎奶菇菌丝体的进一步开发提供理论基础。