MMP28在胰腺癌中的表达和对胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响*

李琳，喻超，潘耀振，陈玲，邓路，雷林翰，孙诚谊*

(贵州医科大学附属医院 肝胆外科，贵州医科大学 肝胆胰脾重点实验室，贵州省肝胆胰脾疾病研究所，贵州 贵阳 550004)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一种恶性程度高、早期诊断困难、病情进展快和预后效果差的消化系统恶性肿瘤，胰腺导管腺癌是其最常见的病理类型，约占全部PC的90%以上[1-2]。目前，PC的主要治疗方式以手术治疗为主，但是大部分PC患者就诊时已发生局部转移，能够进行手术根除性治疗的患者不到20%[3-4]。因此，深入了解PC发生发展的分子生物学基础，探索PC治疗新靶点，有着极为重要的意义[5-7]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一个具有锌依赖性的内肽酶家族，有20多个不同的基质金属蛋白酶,可以分为几类，例如明胶酶、胶原酶、基质溶素及膜型基质金属蛋白酶[8-9]。MMPs不仅具有降解细胞外基质，也可释放生物活性片段和生长因子，从而影响生理和病理过程，例如胚胎发育、组织形态、伤口修复、炎症及癌症发生发展[10-11]。基质金属蛋白酶28(matrix metalloproteinase 28，MMP28)是MMPs家族中的一员，MMP28 mRNA在成年人胰腺中高度表达，目前已有研究称MMP28可以促进肝细胞癌的转移过程，并和不良预后相关[12-13]，还有评估基质金属蛋白酶9，MMP28和金属蛋白酶抑制剂1在大肠癌的诊断和预后中的作用[14]。本研究对MMP28在PC组织与正常胰腺组织的表达进行分析，并通过实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)检测MMP28 在PC细胞株PANC-1中的表达，观察MMP28对PANC-1细胞增殖、迁移与侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1细胞株、主要试剂与仪器

实验所用细胞株为中山大学肿瘤防治中心惠赠，胎牛血清(fatal bovine serun，FBS)、胰蛋白酶、培养基均购自美国gibco公司，Transwell小室购自美国Corning公司，基质胶购自美国Becton Dickinson 公司，RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，MMP28转染试剂购自上海吉凯公司，逆转录试剂盒及SYBR Premix ExTaq试剂盒均购自日本TaKaRa公司，MMP28抗体购自美国proteintech公司，CFX96 Bio-Rad荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司，ChemiDocTMTouch bio-rad化学发光成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1生物信息学分析 通过GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TCGA数据库中MMP28在PC和对照组织中的表达情况，及MMP28对PC患者无病生存期和总生存期的影响。

1.2.2细胞培养及转染 人正常胰腺导管上皮细胞株HPDE和人PC细胞株PANC-1、MIA PaCa-2、Capan-2及BxPC-3分别使用含10%FBS的培养基培养于37 ℃、含5% CO2的恒温恒湿培养箱中。将PANC-1细胞消化铺于培养瓶中，105个细胞/瓶，6 h后分别将MMP28对照试剂(negative control，NC)、MMP28下调试剂(Down-MMP28，D-MMP28)及MMP28上调试剂(Up-MMP28，U-MMP28)加入培养瓶中，分别为MMP28对照组(NC组)、MMP28下调组(D-MMP28组)及MMP28上调组(U-MMP28组)。

1.2.3MMP28 mRNA的表达 采用qPCR实验检测，选择处于对数生长期的HPDE、PANC-1、BxPC-3、Capan-2及MIA-Paca2细胞，提取总RNA，选取吸光度值1.8～2.0的样品进行实验。依照逆转录试剂盒的说明，分别将样品逆转录为cDNA，再选择GAPDH作为内参，使用SYBR Premix ExTaq试剂盒进行qPCR实验。

1.2.4Western blot检测MMP28蛋白的表达 选择3组处于对数生长期的PANC-1细胞，提取其总蛋白，根据蛋白定量结果点样、电泳、转膜、封闭、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜及曝光，用Image Lab软件分析所得条带的灰度值，检测MMP28的蛋白表达量。

1.2.5细胞增殖毒性检测试剂盒(Cell counting kit-8，CCK-8)实验 取3组处于对数生长期的PANC-1细胞消化并计数，按照3×103个/孔的数量接种于96孔板中，设6、24、48和72 h时间节点，然后在每个对应的时间节点再分别设5个复孔，每孔加入CCK-8试剂10 μL，于避光条件下置37 ℃恒温恒湿细胞培养箱孵育2 h后取出，用酶标仪于在450 nm波长处测定吸光度(optical density，OD)。

1.2.6平板克隆实验 取3组处于对数生长期的PANC-1细胞消化并计数，于6孔板中种植1×103个细胞，置37 ℃恒温恒湿细胞培养箱中培养14 d后，用4%多聚甲醛固定30 min、0.25%结晶紫染液染色30 min，于流水中冲洗数遍后置烘箱中烘干，拍照记录。

1.2.7划痕实验 取3组处于对数生长期的PANC-1细胞铺到6孔板中，待孔中细胞长满后，用200μL的枪头进行划痕，然后换无血清培养基进行培养，换液立即拍照，待48 h后再进行拍照。以NC组为对照观察PANC-1细胞迁移能力。

1.2.8Transwell侵袭及迁移实验 取3组处于对数生长期的PANC-1细胞，用无血清培养基饥饿处理24 h后消化并计数，种植前上室按基质胶 ∶无血清培养基=1 ∶8的比例铺上稀释过的基质胶60 μL(迁移实验不加基质胶，其余步骤同上)，然后在上室种植含2×104个细胞的无血清培养基细胞重悬液200 μL，下室加入700 μL完全培养基，置37 ℃恒温恒湿细胞培养箱中培养30 h后取出，用4%多聚甲醛固定30 min、0.25%结晶紫染液染色30 min，用棉签清洗上室、烘箱烘干，置显微镜下拍照记录。以NC组为对照，观察不同分组PANC-1细胞的迁移和侵袭能力。

2 结果

2.1MMP28在PC组织和细胞中的表达及其对预后的影响

通过GEPIA网站分析显示，MMP28在PC组织中的表达高于对照组织，差异有统计学意义(P<0.05，图1A)；MMP28对PC预后的影响结果发现，MMP28的表达对PC的无病生存期和总生存期都有影响，差异有统计学意义(P<0.05，图1B和1C)；qPCR实验结果显示，PC细胞系MMP28 mRNA表达高于胰腺导管上皮细胞(HPDE)，差异有统计学意义(P<0.05，图1D)。

2.2转染后PANC-1细胞MMP28 mRNA 和蛋白质表达

病毒转染后的PANC-1细胞通过qPCR和Western blot检测结果显示，D-MMP28组MMP28 mRNA和蛋白质表达较NC组下调，U-MMP28组MMP28 mRNA和蛋白质表达较NC组上调，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.3MMP28对PANC-1细胞增殖能力的影响

CCK-8实验结果显示，D-MMP28组与NC组比较，PANC-1细胞OD450下降，而U-MMP28组OD450上升，差异有统计学意义(P<0.05，图3A)；平板克隆实验结果显示，D-MMP28组与NC组比较，PANC-1细胞克隆数量下降，而U-MMP28组克隆数量上升，差异有统计学意义(P<0.05，图3B和3C)。

2.4MMP28对PANC-1细胞迁移及侵袭能力的影响

划痕实验结果表明，D-MMP28组与NC组相比，PANC-1细胞迁移能力下降，而U-MMP28组迁移能力上升，差异有统计学意义(P<0.05，图4A和4B)；Transwell迁移和侵袭实验结果表明，D-MMP28组与NC组相比，PANC-1细胞迁移能力和侵袭能力下降，而U-MMP28组迁移能力和侵袭能力上升，差异有统计学意义(P<0.05，图4C和4D)。

3 讨论

PC在早期发生侵袭转移对治疗效果有很大影响，缺乏早期诊断的指标及有效的治疗方法是PC死亡率高的主要原因，因此找到有效的检测指标和治疗方法对治疗PC至关重要[15-16]。MMP28 在PC中的研究还不清楚。本研究通过对TCGA数据库进行分析，结果显示，MMP28在PC组织中的表达与癌旁组织相比升高，并且MMP28的表达对PC的无病生存率和总生存率有影响。进一步通过qPCR实验探究发现MMP28在人PC细胞中的表达比人正常胰腺导管上皮细胞升高。因此，本研究推测MMP28参与PC的发生发展过程。目前已有研究发现MMP28在癌症中的作用[17-19]。Zhang等[20]报道MMP28阳性表达与胃部肿瘤直径，浸润深度，血管浸润，淋巴结和远处转移以及肿瘤淋巴结转移阶段有关并且可以作为人类胃癌侵袭和转移的新的独立预后标志物。Zhou等[21]报道肝细胞癌中MMP28上调通过Notch3信号转导通路促进转移，并可预测不良预后。

注：A为MMP28mRNA在组织中的表达，B、C分别为胰腺癌患者无病生存期和总生存期曲线，D为MMP28 mRNA表达量直条图；(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与HPDE比较,P<0.05。

注：(1)与NC组比较，P<0.05。

为了探究MMP28对PC细胞的影响，本研究分为3组进行实验，首先进行细胞增殖实验，实验结果表明D-MMP28组与NC组相比，PANC-1细胞增殖能力下降，而U-MMP28组增殖能力上升。由此可见MMP28表达增加可促进PANC-1细胞的增殖能力。接下来通过划痕实验和Transwell迁移实验检测MMP28对PANC-1细胞迁移能力的影响。实验结果表明D-MMP28组与NC组相比，PANC-1细胞迁移能力下降，而U-MMP28组迁移能力上升。表明MMP28表达增加可促进PANC-1细胞的迁移能力。还通过Transwell侵袭实验检测MMP28对PANC-1细胞侵袭能力的影响,结果仍显示D-MMP28组与NC组相比，PANC-1细胞侵袭能力下降，而U-MMP28组侵袭能力上升。进一步表明MMP28表达增加可促进PANC-1细胞的侵袭能力。通过一系列细胞功能学实验研究后，结果表明上调MMP28后可以促进PC细胞的增殖，侵袭和迁移。由此初步得出结论，MMP28可能具有调控胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的作用。

注：A为CCK-8实验结果，B、C分别为细胞平板克隆实验的形态学和定量结果；(1)与NC组比较，P<0.05。

注：A、B分别为细胞划痕实验的形态学和定量结果，C、D分别为Transwell实验中细胞迁移能力的形态学和定量结果，E、F分别为Transwell实验中细胞侵袭能力的形态学和定量结果；(1)与NC组比较，P<0.05。

综上所述，MMP28在PC中高表达，并对胰腺癌预后有影响，初步验证了上调MMP28后可促进PC细胞的增殖、侵袭及迁移能力，但是其具体的作用途径，临床数据及分子生物学机制尚未明确，还需要进一步的探索及研究予以阐明。