大孔树脂纯化桑白皮多糖的工艺研究

孙 伟,叶 润,蔡 静,谷清义,乔新荣

(信阳农林学院生物与制药工程学院,河南信阳 464000)

桑白皮为双子叶植物桑科桑(MorusalbaL.)除去栓皮后的干燥根皮,别名桑根皮、桑根白皮、白桑皮、桑皮[1],主产于河南、安徽、浙江、湖南、江苏等地,始载于《神农本草经》[2]。《中国药典》记载桑白皮性味甘寒,归肺脾经,具有泻肺平喘,行水消肿的功效,主治肺热喘咳、尿少水肿、面目肌肤肿胀等症[3]。桑白皮主治消渴尿多,且功效独特,有记载桑白皮“是它药不替也”[4]。 现代医学研究发现,桑白皮具有抗菌[5-6]、抗炎[7]、利尿[8]、降糖[9]、抗HIV、镇静镇痛[10]等作用。近年来研究发现其也具有抗氧化性,并对心脑血管疾病具有预防治疗作用,对损伤的功能细胞也具有修复作用[11-13]。多糖作为桑白皮的主要成分之一,其含量与桑白皮的诸多药理作用密不可分,但是目前对桑白皮多糖的研究还比较少,所以,研究桑白皮多糖的纯化工艺具有一定应用价值和必要性。

大孔树脂由于其独特的多孔结构及材料性质,多应用于黄酮[14]、多酚[15]、多糖等[16-17]的分离纯化。目前,利用大孔树脂纯化桑白皮多糖的研究尚未被报道,因此本实验以10种不同型号大孔树脂的分离、纯化效果为研究目标,筛选出最佳的纯化树脂及最优的分离条件,为更高效的开发桑白皮和利用桑树资源提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑白皮 2019年02月购于信阳美锐大药房有限公司,并经信阳农林学院中药教研室陈琼教授鉴定;葡萄糖标准品 合肥博美生物科技有限责任公司;蒽酮 色谱纯,上海展云化工有限公司;D-101、AB-8、DM301、DA-201、H103、NKA-9型大孔树脂 天津浩聚树脂科技有限公司;HP20、X-5、HPD-722、HPD300型大孔树脂 山东鲁抗立科药物化学有限公司;浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、乙醇均 分析纯,武汉市中天化工有限责任公司;所有实验用水 均为二次重蒸水。

UV-1600紫外可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司;ME104电子分析天平 瑞士梅特勒公司;HG101-3A电热鼓风干燥箱 南京卓鼎干燥设备厂;400Y多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司);SCQ-168数控加热超声波清洗机 上海声彦超声波仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;DKZ-2B电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司;层析柱(30×300 mm) 江阴市新辉层析设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑白皮的预处理 将精选的桑白皮清洗后,置鼓风干燥箱60 ℃下干燥4 h至恒重,粉碎后过80目分样筛,备用。

1.2.2 桑白皮多糖的粗提 取桑白皮粉200 g,置于2000 mL烧杯中,加入6倍量的蒸馏水,在50 ℃水浴中浸泡提取8 h,并于50 ℃下300 W超声30 min,过滤得提取液。将提取液减压蒸馏浓缩至粘稠状,冷却后加入95%的乙醇100 mL使糖类沉淀,4 ℃静置2 h后过滤,反复2～3次,得滤渣冷冻干燥为桑白皮粗多糖,4 ℃保存备用[18]。

1.2.3 多糖含量的测定 采用蒽酮-硫酸法[19]测定桑白皮多糖纯化前后的多糖含量。

1.2.4 大孔树脂的处理 取十种不同型号的大孔树脂,先用重蒸水洗涤,接着以3倍柱体积的95%乙醇浸泡24 h,再用重蒸水洗涤至无乙醇味;将处理好的大孔树脂分别用3倍柱体积,质量浓度为6%的HCl和质量浓度为6%的NaOH溶液浸泡3 h,最后用重蒸水洗至中性[20-22]。

1.2.5 静态吸附的吸附率和解析率考察 取处理过的十种不同型号的大孔树脂各1 g,放入150 mL具塞锥形瓶中,再加入30 mL质量浓度为4.0 mg/mL桑白皮粗多糖水溶液,将锥形瓶置于25 ℃恒温摇床上振荡24 h,取上清液,按照“1.2.3”项中方法处理测定A625值,计算上清液粗多糖的含量,计算吸附量(Q)及吸附率(P)。

Q(mg/g)=(C0-C1)V/m;

P(%)=[(C0-C1)/C0]×100

将吸附后的大孔树脂过滤,重蒸水洗涤后,再加入质量分数85%的乙醇溶液50 mL,在同样条件的摇床中进行解吸,取解吸液按照“1.2.3”项中方法处理测定A625值,计算解吸率(D)。

D(%)=[C2/(C0-C1)]×100

注:C0为粗多糖溶液中多糖的原始含量(mg/mL),C1为大孔树脂吸附后溶液中多糖的含量(mg/mL),C2为解吸液中多糖的含量(mg/mL),V为粗多糖溶液体积(mL),m为大孔树脂的质量(g)。

1.2.6 静态吸附的动力学曲线 取处理过的D-101型大孔树脂1 g,放入150 mL具塞锥形瓶中,再加入30 mL质量浓度为4.0 mg/mL桑白皮粗多糖水溶液,将锥形瓶置于25 ℃恒温摇床上振荡吸附6 h,每0.5 h取1 mL溶液,测定吸光值,计算吸附率,绘制吸附曲线[23]。

1.2.7 D-101型大孔树脂动态吸附中对吸附效果的影响条件考察

1.2.7.1 pH 取处理好的D-101型号大孔树脂1.0 g,装入Ф20 mm×200 mm的层析柱里,将1.2.2中的粗多糖配制成质量浓度为4.0 mg/mL溶液,用稀盐酸分别调节pH=2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0,以2.0 BV/h(1 BV=45 mL)的速度上样并静置2 h,保持柱温在25 ℃,每5 mL收集流出液,测定吸光值[24],计算大孔树脂的吸附率。

1.2.7.2 上样速度 按照以上确定的最佳条件,选用处理好的D-101型号大孔树脂,将1.2.2中的粗多糖配制成质量浓度为4.0 mg/mL溶液,调节pH=3.0,分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h的速度上样并静置2 h,保持柱温在25 ℃,每5 mL收集流出液,测定吸光值,计算大孔树脂的吸附率。

1.2.7.3 上样浓度 按照以上确定的最佳条件,选用处理好的D-101型号大孔树脂,将1.2.2中的粗多糖分别配制成质量浓度为1.0、2.0、3.0、3.0、5.0、6.0 mg/mL溶液,调节pH=3.0,以2.0 BV/h的速度上样并静置2 h,保持柱温在25 ℃,每5 mL收集流出液,测定吸光值,计算大孔树脂的吸附率。

1.2.8 D-101型大孔树脂动态吸附中对解吸效果的影响因素考察

1.2.8.1 洗脱剂浓度 将制备好的粗多糖配制成质量浓度为4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7确定的最佳条件上样,依次用150 mL的25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液洗脱,洗脱速度在1.0 BV/h,分段收取洗脱液,测定吸光值,计算大孔树脂的解吸率。

1.2.8.2 洗脱剂用量 将制备好的粗多糖配制成质量浓度为4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7确定的最佳条件上样,用75%乙醇溶液洗脱,洗脱剂用量分别在2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 BV,洗脱速度在1.0 BV/h,分段收取洗脱液,测定吸光值,计算大孔树脂的解吸率。

1.2.8.3 洗脱流速 将制备好的粗多糖配制成质量浓度为4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7确定的最佳条件上样,用75%乙醇溶液洗脱,用量在3.5 BV,控制洗脱速度分别在1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h,分段收取洗脱液,测定吸光值,计算大孔树脂的解吸率。

1.3 数据处理

每组实验平行做3次,结果采用平均值±标准差形式表示,单因素实验采用SPSS 13.0软件和Excel 2010软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定的方法学考察

2.1.1 标准曲线的绘制 分别精密移取0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞试管中,加重蒸水至2.0 mL,再分别精密加入0.2%蒽酮-浓硫酸溶液5.0 mL,振荡后置90 ℃水浴20 min后移出,冷却后在625 nm波长下测其吸光度A值。以葡萄糖浓度(x)为横坐标,吸光值(y)为纵坐标,作标准曲线。得线性回归方程y=0.0921x+0.0642,相关系数r=0.9995,在0.0020～0.1600 mg/mL浓度区间内线性关系良好。

2.1.2 精密度测定 精密称量0.0010 g桑白皮粗多糖,完全溶解后置于25 mL容量瓶中定容,摇匀。精密移取0.2 mL于具塞试管中,按照“2.1.1”项中方法处理测定A625值,得RSD为0.802%(n=6),说明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性测定 准确称量6份桑白皮粗多糖0.0100 g,按照“2.1.1”项中方法处理,得RSD为0.915%(n=6),说明该方法重复性良好。

2.1.4 稳定性测定 准确移取桑白皮粗多糖待测液0.4 mL于25 mL容量瓶中用重蒸水定容,按照“2.1.1”项中方法检测,分别于0、15、30、45、60、75、90、105、120 min检测吸光值,计算RSD值,得RSD为1.102%(n=9),说明桑白皮粗多糖待测液在2 h内稳定。

2.1.5 加样回收率测定 准确移取6份0.4 mL桑白皮粗多糖待测液,分别精密加入0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液0.4 mL,按照“2.1.1”项中方法检测,测定A625值,得平均回收率为98.04%,RSD为1.81%(n=6)。

2.2 大孔树脂类型的筛选

根据“1.2.4”项中大孔树脂的处理方法得十种不同型号的大孔树脂吸附效果(见表1),H103、D-101、HPD300、AB-8这四种大孔树脂的吸附量较高,但是 H103的解吸率最低,这可能与 H103的比表面积最大有关系;HPD300的吸附率最大,但是解吸率不足60%,这也可能与HPD300的比表面积比较大有关系;HPD-722、DA-201、D-101、AB-8这三种树脂的比表面积适中,表现出良好的吸附、解吸性能,且D-101的综合数值最优,故最终选取D-101型大孔树脂为接下来实验所使用的树脂。

表1 十种不同型号的大孔树脂吸附和解吸效果Table 1 Adsorption and desorption effects of ten different types of macroporous resins

2.3 静态吸附的动力学曲线

如图1所示,D-101型大孔树脂对多糖的吸附在前3.0 h呈上升的趋势,在3.0 h的时候达到吸附的最大值,之后基本达到饱和,吸附趋于稳定。

图1 静态吸附的动力学曲线Fig.1 Kinetic curve of static adsorption

2.4 D-101型大孔树脂动态吸附中对吸附效果的影响条件考察

2.4.1 pH对吸附效果的影响 如图2所示,当样品的pH调节为3.0时上样,此时D-101型大孔树脂对多糖的吸附效果最好。pH过小或者过大都会阻碍大孔树脂的吸附,主要因为酸碱度对多糖溶解度和化学性质影响较大[25],相对来说弱酸性条件下更容易被树脂吸附,被洗脱剂解吸。故最终确定把样品pH调节到3.0进行上样。

图2 pH对吸附效果的影响Fig.2 Effect of pH on adsorption efficiency

2.4.2 上样速度对吸附效果的影响 如图3所示,当上样速度在2.0 BV/h时,D-101型大孔树脂对多糖的吸附效果最佳。上样速度太快会导致大孔树脂来不及吸附,吸附率大幅度降低;上样量太慢会影响整体的纯化效率[26]。综合各因素考虑,确定上样速度在2.0 BV/h为最佳。

图3 上样速度对吸附效果的影响Fig.3 Effect of sample loading rate on adsorption efficiency

2.4.3 上样浓度对吸附效果的影响 如图4所示,当上样浓度低于4.0 mg/mL 时,大孔吸附树脂还有较多的吸附多糖的位点,因此吸附率会随着浓度的增加而增大;但随着浓度的进一步增加,溶液中的杂质含量也会越来越多,与桑白皮多糖成分竞争吸附树脂的位点的作用也会越来越强[27],因此吸附率稍有下降。故最佳上样液质量浓度为4.0 mg/mL。

图4 上样浓度对吸附效果的影响Fig.4 The effect of sample concentration on adsorption efficiency

2.5 D-101型大孔树脂动态吸附中对解吸效果的影响因素考察

2.5.1 洗脱剂浓度对解吸效果的影响 如图5所示,D-101型大孔树脂的最佳洗脱浓度为75%的乙醇,浓度过大或者过小都不利于多糖的解吸,根据“相似相溶”原理,桑白皮乙醇提取物中多糖极性较大,低浓度的乙醇不能破坏树脂与多糖形成的氢键,故解吸率较低。而高浓度乙醇会使极性与多糖极性相差变大[28],解吸率亦会降低,因此选用浓度为75%的乙醇作为解吸液。

图5 洗脱剂浓度对解吸效果的影响Fig.5 The effect of eluent concentration on desorption efficiency

2.5.2 洗脱剂用量对解吸效果的影响 如图6所示,低于3.5 BV时随着洗脱剂用量的增加,解吸率逐渐增加;当洗脱剂用量大于3.5 BV时,解吸率随洗脱剂用量的增加变化不明显。从理论上讲,洗脱剂的用量越多越能完全将吸附在树脂上的多糖洗脱下来,但是过量的洗脱剂会增加成本和后续浓缩的工时。因此,综合考虑解吸率、成本和工时,最佳洗脱剂用量为3.5 BV。

图6 洗脱剂用量对解吸效果的影响Fig.6 Effect of eluent dosage on desorption efficiency

2.5.3 洗脱流速对解吸效果的影响 如图7所示,随着解吸液流速的增加,桑白皮多糖的解吸率呈下降的趋势。可能是因为流速的加快导致解吸液与大孔树脂不能充分接触,不能使吸附在大孔树脂上的桑白皮多糖成分被解吸出来,最佳洗脱流速为1.0 BV/h。

图7 洗脱流速对解吸效果的影响Fig.7 Effect of elution flow rate on desorption efficiency

2.6 验证纯化试验

按照以上确定的最优条件,用处理好的D-101型号大孔树脂,将2.1.2中的粗多糖配制成质量浓度为4.0 mg/mL溶液,调节pH=3.0,以2.0 BV/h的速度上样并静置2 h,保持柱温在25 ℃,用75%的乙醇溶液洗脱,洗脱剂用量分别在3.5 BV,洗脱速度在1.0 BV/h,收集洗脱液,测定吸光值,计算桑白皮多糖的纯度,3次平行实验结果如表2。经过D-101型大孔树脂纯化处理后,桑白皮多糖的纯度从16.12%±1.20%提高到了74.45%±1.15%,可以看出在此工艺设置下,D-101大孔树脂纯化桑白皮多糖切实可行,可以获得较高的纯化效率。

3 结论

通过对10种大孔树脂的吸附量、吸附率和解吸率进行研究比较,筛选出桑白皮多糖的最佳纯化树脂为D-101型大孔树脂。再经过单因素试验考察,得出最佳上样条件为:pH=3.0、上样速度为2.0 BV/h、上样浓度为4.0 mg/mL;最佳洗脱条件为:75%的乙醇洗脱液、洗脱剂用量为3.5 BV、流速为1.0 BV/h。经过该工艺纯化后,桑白皮多糖的纯度从16.12%提高到了74.45%。该工艺根据方法学考察验证稳定可行,为桑白皮中多糖的富集、纯化提供了实验依据,也为桑白皮、桑树资源的有效开发利用提供了新的途径,且大孔树脂的成本低廉、操作简单再生容易、效率高,可为大规模生产提供科学依据。