花青素对不同直链淀粉含量的淀粉理化特性的影响

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(1.华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070;2.中南林业科技大学,稻谷及副产物深加工国家工程实验室,湖南长沙 410004)

花青素(Anthocyanin)是广泛存在于水果、谷物和蔬菜中的一类水溶性天然色素,结构主要是由C6-C3-C6为基本的C骨架组成的,属于酚类化合物中的类黄酮类[1]。花青素具有较高的抗氧化活性,是目前发现的最有效的抗氧化剂之一。此外,花青素还具有抑制肿瘤、降低血脂、增强视力及消炎等多种药理功能[1-2]。研究表明,花青素在食品中有着广泛的应用,一是直接开发为健康产品,二是作为食品添加剂使用[3]。例如,以紫薯和大米为主要原料压榨酿出的紫薯酒,其体外抗氧化活性高于葡萄酒[4];Sui[5]研发出一种功能性面包——“花青素营养强化面包”,为糖尿病患者提供了更健康的选择。

花青素大量存在于黑米中,作为一种由禾本科植物稻经长期培育形成的一类具有特殊香味的香米品种[6],黑米的营养素含量优于普通大米[7]。研究表明,黑米比普通白米难消化和吸收[8-9],这将有利于减缓人体餐后血糖升高,治疗肥胖和糖尿病等慢性疾病[10]。然而,目前黑米比普通白米消化慢的原因尚未研究清楚。推测其可能有三方面因素,一是黑米中富含的花青素或膳食纤维通过抑制淀粉酶的活性,从而降低淀粉的消化速率;二是淀粉与花青素发生相互作用,形成耐酶解的结构或者影响了淀粉的理化性质,进而影响淀粉消化[11];三是增加抗性淀粉含量,作者前期研究已证明(未发表)。对于多酚影响淀粉的理化性质,前人早有研究报道。例如,Xiao等[12]研究发现黑茶多酚能显著降低淀粉的初始温度、峰值温度、终值温度以及糊化焓值。Karunaratne等[13]研究发现阿魏酸可以降低玉米淀粉的糊化温度和糊化焓。Chai等[14]研究发现,茶多酚能与玉米淀粉中的直链淀粉发生相互作用,进而改变了淀粉的理化特性。然而,目前花青素与淀粉之间的相互作用及其机制尚未见研究报道。

因此,有必要研究花青素对淀粉理化性质的影响,进而解释黑米比白米消化慢的原因,旨在填补这方面研究的空白并为开发新型花青素类淀粉食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低直链大米淀粉(LAR)(直链淀粉含量为3.15%，淀粉含量为90.006%)，提自珍珠糯米 阳新县祥云粮油食品有限公司；中直链大米淀粉(IAR)(直链淀粉含量为8.39%，淀粉含量为90.092%，提自赛亚东北香米)、高直链大米淀粉(HAR)(直链淀粉含量为19.39%，淀粉含量为90.431%，提自赛亚桃花米) 襄樊赛亚米业有限公司，上述三种淀粉均依据文献[15]提取；黑米花青素 本实验室自制，纯度79.66%；其他试剂 均为分析纯。

204-F1差示扫描量热仪 德国Netzsch公司;AR2000ex流变仪 美国TA Instryment有限公司;Nexus470傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司;Quanta200扫描电子显微镜 荷兰FEI公司;X’Pert PRO X射线衍射仪 荷兰帕钠科公司。

1.2 实验方法

1.2.1 淀粉与碘结合能力的测定 参考柴艳伟[16]的方法稍作改动,准确称取50 mg三种淀粉,分别添加0%、1%、2%、5%和10%的花青素(基于淀粉质量),加入去离子水,配制成2%淀粉乳溶液。沸水浴加热30 min,冷却至室温,取0.1 mL混合液加入0.1 mL碘溶液(0.8% KI,0.08% I2),用水定容至5 mL,混合均匀,避光反应15 min。之后于500～900 nm处进行全波长扫描,空白为相应浓度花青素与碘试剂混合的样品。

1.2.2 淀粉热力学性质的测定 参考李蟠莹等[17]的方法:分别添加0%、1%、2%、5%和10%的花青素(基于淀粉质量)于三种淀粉中,采用标准铟对差示扫描量热仪(DSC)进行温度和热焓的校正。称取混合物3 mg加入PE坩埚中,加入一定量的去离子水,保证混合物的水分含量为70%左右,密封,4 ℃下平衡 24 h。之后用DSC测定体系的热力学性质,测试条件为:以10 ℃/min的速度从25 ℃加热到100 ℃。以空坩埚作为空白对照。

1.2.3 淀粉流变性质的测定

1.2.3.1 静态流变 分别添加0%、1%、2%、5%和10%的花青素(基于淀粉质量)于三种淀粉中,然后向混合物中加入去离子水配成淀粉质量为5%的淀粉浆,混匀后置于沸水浴糊化30 min,冷却至室温后立即测定。利用流变仪测定淀粉的表观黏度随剪切速率的变化。测定条件为:静态测量模式,测试温度为25 ℃,20 mm平板,间隙0.5 mm,剪切速率为0.1～100 s-1。

1.2.3.2 动态流变 按照1.2.3.1的方法,制备8%的淀粉糊样品,冷却至室温后立即测定其弹性模量(G′)和黏性模量(G″)随震荡频率的变化。测定条件为:20 mm 平板,间隙0.5 mm,测试温度为25 ℃,震荡频率0.1～10 Hz,应力为2%。

1.2.4 傅里叶红外光谱(FT-IR)的测定 按照1.2.3.1的方法配制10%的淀粉糊,冷却后4 ℃贮存7 d,冷冻干燥后粉碎过100目筛,采用FT-IR对样品进行测定,1 mg的样品与120 mg的KBr混合,充分研磨均匀后,放入模具中压片。测试条件为:扫描次数为32次,分辨率为4 cm-1,测量范围为4000～500 cm-1。

1.2.5 淀粉结晶性质的测定 按照1.2.3.1的方法配制10%的淀粉糊,冷却后4 ℃贮存7 d,冷冻干燥后粉碎过100目筛,采用全自动X-射线衍射仪对样品进行测定,特征射线Cu靶,管压40 kV,电流40 mA。扫描范围为5～45 °(2θ),扫描速度为4 °/min。参照Miao等[18]的方法计算下列参数。

Rc(%)=Ac/(Ac+Aa)(100

式中:Rc为相对结晶度,Ac为结晶区面积,Aa为非结晶区面积。

1.2.6 淀粉颗粒形貌观察 按照1.2.3.1的方法配制10%的淀粉糊,冷却后4 ℃贮存7 d,冷冻干燥后粉碎过100目筛,将样品用双面胶固定在扫描电镜样品台上,真空喷金,然后用扫描电镜(SEM)观察。

1.3 数据分析

使用Origin 8.6和Excel 2010作图,对采集的实验数据采用SAS 9.2进行相关性分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 花青素对淀粉与碘结合能力的影响

由图1可知,加入花青素后,曲线的吸光度下降,表明花青素可以与淀粉结合,从而抑制直链淀粉-碘、支链淀粉-碘复合物的形成。淀粉与碘的吸光值曲线的峰值均向短波长方向偏移,且在HAR-花青素体系中,吸光度峰值的偏移程度最大。这可能是由于花青素与直链淀粉结合,使得直链淀粉与碘的结合能力下降,吸收峰值发生蓝移。吸光值下降的程度越显著,说明花青素对淀粉与碘结合物的形成影响越显著[19]。对于LAR而言,随花青素含量的增加,曲线的吸光度降低,但降幅较小;对于IAR而言,添加少量的花青素时,吸光度降幅较低,但是在高添加量时,吸光度的降幅较大,对HAR而言,在花青素添加量较少时,吸光度便明显降低,这也说明花青素与直链淀粉结合的比例更高。对三种淀粉而言,当添加10%的花青素时,曲线的吸光值峰值相较于原淀粉分别下降14.56%、25.11%和33.83%。说明花青素对淀粉与碘的结合与直链淀粉含量相关。其他研究者也发现了相似的现象,例如Yang等[20]人研究发现毛竹叶多酚能和淀粉发生相互作用,并使淀粉-碘复合物的吸光度降低。

图1 花青素对LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)与碘结合能力的影响Fig.1 Effects of anthocyanins on the binding ability of LAR(a),IAR(b)and HAR(c)to iodine

2.2 淀粉对花青素热特性的影响

通过DSC可以测定淀粉糊化温度和糊化焓,热焓值反映了糊化淀粉在贮存过程中相邻的双螺旋结构结合形成的结晶体的熔化。从表1可知,添加10%花青素的三种体系相对于原淀粉糊化温度分别下降了6.99%、7.64%、9.35%;峰值温度分别下降了3.52%、6.13%和7.44%;糊化焓值分别下降了23.92%、44.91%和59.89%,且终止温度随花青素添加量增加均呈下降趋势。这可能是因为花青素的亲水性羟基在某种程度上与直链淀粉非结晶区发生了结合,改变了淀粉结晶区与非结晶区的耦合力,从而减小了破坏淀粉分子结构时所需要的能量[21]。这与Wu等[22]报道的茶多酚对淀粉糊化焓值的影响结果一致。且添加不同比例的花青素后,体系的糊化温度、糊化焓的下降趋势与直链淀粉含量相关。

表1 淀粉-花青素体系的糊化温度及焓值Table 1 Gelatinization temperatures and enthalpy of starch-anthocyanin

2.3 花青素对淀粉流变特性的影响

2.3.1 静态流变特性 从图2可知,随着剪切速率的升高,三种淀粉的表观黏度均降低,具有剪切变稀的性质,为假塑性流体。在淀粉糊中,线性大分子链(主要为直链淀粉)相互缠绕,阻碍了分子的相互运动。当给予剪切作用时,分子链取向就会被拉直,缠结点逐渐减少,流动阻力降低,从而使表观黏度下降[23]。此外,从图2可知,添加不同比例的花青素后,体系的黏度相对于原淀粉呈下降趋势,这可能是由于花青素与直链淀粉产生了氢键相互作用,使淀粉与花青素之间的缠绕作用加强,淀粉体系中分子链节的顺向性增强,流动阻力降低,表观黏度下降[24]。并且体系的黏度相对于原淀粉减小的程度和直链淀粉含量相关。其他学者也发现多酚类物质降低淀粉黏度的现象,例如Chai等[14]研究发现,茶多酚能够显著降低高直链玉米淀粉的黏度。

图2 花青素-LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)体系的表观黏度随剪切速率的变化Fig.2 Change apparent viscosity with shear rate of anthocyanins-LAR(a),IAR(b)and HAR(c)systems

2.3.2 动态流变学特性 储能模量(G′)反映的是物体的固体性质;损耗模量(G″)反映的是物体的液体性质;tanδ是G″与G′的比值,表示物体弹性和黏性的相对大小。从图3可以看出,随着扫描频率的增加,三种淀粉及淀粉-花青素体系的G′与G″均逐渐增大。所有样品均表现为一种典型的弱凝胶动态流变学性质。淀粉-花青素体系的tanδ值均大于原淀粉,说明花青素的加入使得体系的弹性降低。对三种淀粉-花青素体系而言,随着花青素含量的增加,淀粉-花青素体系的G′与G″下降越显著。这是因为花青素的加入,减少了淀粉糊体系内部直链淀粉分子链段间的缠结点,从而破坏了凝胶体系的网络结构[25]。且花青素对淀粉体系粘弹性的影响与直链淀粉含量相关。Zhang等[26]的研究表明芦丁和槲皮素可能与小麦淀粉中的直链淀粉通过疏水作用结合到螺旋内腔中,导致淀粉链之间交联缠绕的机会减少,因此凝胶网络强度降低。

图3 花青素-LAR(a,b)、IAR(c,d)、HAR(e,f)体系的动态黏弹性Fig.3 Dynamic viscoelastic properties of anthocyanin-LAR(a,b),IAR(c,d)and HAR(e,f)systems

2.4 花青素对淀粉红外图谱的影响

从图4中可知,三种淀粉均在3400 cm-1附近出现一个信号极强的-OH键的伸缩峰。然而,在加入花青素之后,-OH吸收峰向低波长方向发生了轻微的红移,说明分子间的氢键作用增强。这主要是由于淀粉链上羟基的O电负性大,与多酚羟基上的H发生静电吸引作用,使-OH的电子更偏向O,-OH共价键被拉伸,进一步使H周围的电子云密度降低,导致羟基峰发生红移[27]。在2930 cm-1的峰是C-H伸缩振动峰,与淀粉中的蛋白质或脂质相关[28]。1400 cm-1的峰是C-OH伸缩振动峰[29]。添加花青素后淀粉的红外图谱与原淀粉的峰形相似,说明花青素的加入没有破坏淀粉的基本结构,且花青素与淀粉主要通过非共价键(氢键或者疏水相互作用)结合。据报道,多酚与淀粉之间主要通过氢键发生相互作用,且氢键的形成抑制了淀粉自身螺旋的形成,降低了其有序性[30]。

图4 花青素-LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)体系的红外图谱Fig.4 FT-IR spectra of anthocyanin-LAR(a),IAR(b)and HAR(c)systems注：a→e表示花青素的添加量为:0%、1%、2%、5%、10%。

2.5 花青素对淀粉结晶性质的影响

淀粉颗粒是由结晶区与非结晶区交替构成的多晶体体系,且能呈现一定的X射线衍射图谱,结晶区呈现尖峰特征,非结晶区呈现出弥散特征[31]。原淀粉在2θ为17°出现了较强的衍射峰,为B型特征峰[32]。在2θ为20°时出现的吸收峰为淀粉内的油脂酸类与直链淀粉在回生过程中形成的复合物[33]。由图5及表2可知,随着花青素添加比例的增加,复合物在2θ角为17°衍射峰峰强降低,添加10%花青素的LAR、IAR、HAR体系结晶度相对于原淀粉分别下降了7.99%、15.49%和24.87%。这说明花青素能够有效抑制淀粉的回生,且抑制回生的效果与直链淀粉含量相关。Liu等[30]研究表明原花青素可以有效抑制淀粉回生,一方面可能是由于原花青素与直链淀粉分子通过氢键结合,阻碍了淀粉分子间双螺旋结构的形成,从而达到抑制淀粉回生的作用。另一方面可能是原花青素与水分子同时进入到淀粉颗粒中,在回生过程中与支链淀粉的短链结合,抑制其短链分子间的双螺旋作用。

图5 花青素-LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)体系的XRD图谱Fig.5 XRD pattern of anthocyanin-LAR(a),IAR(b)and HAR(c)systems注：a→e表示花青素的添加量为:0%、1%、2%、5%、10%。

表2 花青素-LAR(a)、IAR(b)、HAR(c)体系的相对结晶度Table 2 Relative crystallinity of anthocyanin-LAR(a),

2.6 花青素对淀粉微观结构的影响

从图6可知,糊化后4 ℃储存7 d的大米淀粉经过冷冻干燥后,结构紧密,有轻微的凸起。在加入花青素后,体系的结构变得疏松多孔,且随着花青素添加量的增加,结构越来越疏松,孔洞也明显增多。孔洞的形成是由于在冷冻干燥的过程中,淀粉脱水而形成。而孔洞的疏松程度取决于淀粉的回生程度,回生程度越小,孔洞越疏松。这表明花青素的加入抑制了淀粉的回生,可能的原因是花青素通过非共价键作用与淀粉发生了相互作用,阻碍淀粉分子之间相互聚集[20];也可能是加入花青素后水分的蒸发减慢,体系含水量比原淀粉高,增加了淀粉分子的自由度,阻碍了淀粉分子之间的聚集,从而抑制淀粉的回生。其他学者研究也发现多酚可以使得淀粉的微观结构变得疏松,例如Yang等[20]研究发现毛竹叶多酚可以使淀粉凝胶的微观结构变得更加疏松,而对于这一现象的确切解释仍然有待进一步的研究。

图6 花青素-LAR(A～E)、IAR(A1～E1)、HAR(A2～E2)体系的表面结构Fig.6 Surface structures of anthocyanin-LAR(A～E),IAR(A1～E1),and HAR(A2～E2)systems注:A、A1、A2:0%花青素;B、B1、B2:1%花青素;C、C1、C2:2%花青素;D、D1、D2:5%花青素;E、E1、E2:10%花青素。

3 结论

本实验以不同比例的花青素与直链淀粉含量不同的淀粉复合,考察了花青素对不同直链淀粉含量的淀粉理化特性的影响。结果表明,花青素能与直链和支链淀粉发生结合。随着花青素添加比例的增加,淀粉的糊化温度、糊化焓、结晶度、表观黏度和黏弹性相对于原淀粉均发生明显下降。淀粉的红外光谱图表明花青素与淀粉发生了非共价键作用,这种作用可能是氢键或疏水相互作用。通过扫描电镜,观察淀粉的微观形貌发现,随着花青素添加量的增加,淀粉结构变得疏松多孔,说明样品的回生程度减小。本实验证明花青素的添加能够有效改变淀粉的理化特性,这为进一步研究黑米比白米消化慢的原因提供了理论依据。