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傣药双姜胃痛丸对小鼠的镇痛作用研究

2020-07-21李宝晶

中国民族民间医药 2020年12期
关键词:甲醛脑组织阿司匹林

李宝晶 王 亭

云南中医药大学中药学院 昆明 650500

双姜胃痛丸为傣药成药,其组方被列为傣医的经典药方。全方由毫命(姜黄CurcumalongaLinn.)、补累(紫色姜ZingiberpurpureumRosc.)、波波罕(地不容StephaniaepigaeaH.S. Lo)、罕好帕(石菖蒲AcorustatarinowiiSchott)、反帕嘎[苦菜子Brassicaintegrifolia(West)O. E. Schulz]组成。其中姜黄、紫色姜性温热,入风、土塔,具有通气消胀、活血止痛之功,为主药;石菖蒲性热,入风、水、土塔,主治脘腹胀痛,不思饮食,为辅助药;地不容、苦菜子味苦,性凉,既有凉血止痛之功,还可抑制主药之燥性,为抑制药[1]。在功能主治方面,傣医认为双姜胃痛丸能“通塞勒,塞拢,补塔铃。兵接崩接短,短嘎习不利恶来”,即“理气止痛,和胃降逆”,主治中焦气滞所致胃脘痞满胀痛,嗳气吞酸,以及慢性浅表性胃炎见上述证候者[2]。本研究采用热板法和甲醛足底注射致痛法,研究双姜胃痛丸全方的镇痛作用,并探讨其镇痛作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 昆明小鼠,SPF级,雌雄均有,体重18~22 g,购自成都达硕生物科技有限公司,许可证号:SCXK(川)2013-24。实验用小鼠饲料及垫料,购自湖南斯莱克景达生物科技有限公司,许可证号:2016-0002。实验动物进驻动物饲养房后,实验室条件下适应性喂养1周。实验方法及条件经云南中医药大学动物实验中心伦理委员会审查合格。

1.2 试剂和仪器 双姜胃痛丸(西双版纳版纳药业有限责任公司,批号:170117)。20倍体积75%乙醇浸泡过夜后充分研磨,滤去残渣,收集滤液,旋转蒸发浓缩后减压干燥,4 ℃保存,用前以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制。阿司匹林肠溶片(50 mg,湖南亚大制药有限公司,批号:20160401),用前以0.5% CMC-Na配制。肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(20190520)、5-羟色胺(HT)检测试剂盒(20190422)、前列腺素(PG)E2(20190710)、谷氨酸(Glu)(20190515)检测试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。

电子天平(ALC2104,北京赛多利斯天平有限公司),酶标仪(1500,Thermo Fisher),智能热板仪(RB-200,成都泰盟科技有限公司),型恒温水浴锅(HH-6,国华电器有限公司),MyCycler PCR仪、MyiQ梯度单色实时定量PCR仪(Bio-Rad)。

1.3 实验方法

1.3.1 镇痛实验 ① 热板法:取雌性小鼠40只,随机分成空白组(0.5% CMC-Na)、阳性对照组(阿司匹林,0.2 g/kg)和SJWT低、中、高剂量组(0.75 g生药/kg、1.50 g生药/kg、3.00 g生药/kg)共5组,每组8只。实验前测定各组小鼠给药前痛阈值即基础痛阈值。实验开始每天灌胃给药1次,连续7天。末次给药后30、60、90min分别测定各鼠的痛阈值1次。超过60 s 未出现痛反应者,即刻停止实验,痛阈值以 60 s 计算。

② 甲醛致痛法:取小鼠48只,雌雄各半,随机分成空白组(0.5% CMC-Na)、模型组(0.5% CMC-Na)、阳性对照组(阿司匹林,0.2 g/kg)和双姜胃痛丸低、中、高剂量组(0.75 g生药/kg、1.50 g生药/kg、3.00 g生药/kg)共6组,每组8只。末次给药后2 h,除空白组外,各组小鼠右后足底行皮下注射以2.5%甲醛溶液25 μL/只。注射后将小鼠置 2000 ml烧杯中,分两个时相(Ⅰ相,0~5 min,早发相)和(Ⅱ相,10~30 min,迟发相)观察记录小鼠舔、咬右后足的累计时间并计算疼痛抑制率。疼痛抑制率=(模型组舔足累计时间-给药组舔足累计时间)/模型组舔足累计时间×100%。

1.3.2 镇痛机制研究 镇痛实验②观察结束后处死小鼠,取脑组织和右后足,-80 ℃保存备用。取小鼠脑组织,加生理盐水制成10%匀浆液,4 ℃,3000 rpm离心10 min,取上清液,按检测试剂盒使用说明,测定5-HT和Glu含量。分离小鼠右后足组织,冰上剪碎,取适量组织加生理盐水匀浆,4 ℃,3000 rpm离心10 min,取上清液,测定PGE2和TNF-α含量。

另取右后足组织适量,Trizol试剂一步法提取总RNA,采用20 μL逆转录反应体系,42 ℃温育60 min,70 ℃加热10 min后终止反应,冰浴冷却,得cDNA第一链。采用SYBR green PCR试剂盒,优化反应条件:预变性,50 ℃,2 min;95 ℃,10 min;变性,95 ℃,15 s;退火/延伸,60 ℃,30 s,40个循环。溶解曲线分析:95 ℃:15 s;60 ℃:30 s;95 ℃:15 s。反应结束,提取各基因Ct值,2-ΔΔCt法进行分析。MCP-1引物根据PubMed查询对应物种目的基因mRNA序列,以CDS序列设计,序列见表1。

表1 引物序列

2 实验结果

2.1 双姜胃痛丸对热刺激小鼠痛阈的影响 灌胃给药1周后,阿司匹林在末次给药后30 min、60 min能显著提高小鼠热刺激体表的痛阈值;双姜胃痛丸在末次给药后60 min能显著提高小鼠热刺激体表的痛阈值。具体见表2。

2.2 双姜胃痛丸对甲醛致痛小鼠痛反应的影响 右后足底注射甲醛后,模型组小鼠出现明显舔足、咬足反应。与模型组相比,阿司匹林组及双姜胃痛丸高剂量组小鼠Ⅰ时相舔足、咬足累计时间减少,疼痛抑制率增加;阿司匹林组及双姜胃痛丸低、中、高剂量组小鼠Ⅱ时相舔足、咬足累计时间均显著减少,疼痛抑制率增加,且双姜胃痛丸的作用表现出剂量依赖性。具体见表3。

表2 双姜胃痛丸对热刺激小鼠痛阈的影响

表3 双姜胃痛丸对甲醛致痛小鼠痛反应的影响

2.3 双姜胃痛丸对甲醛致痛小鼠炎症反应的影响 对小鼠甲醛注射足组织中炎性因子含量的研究结果表明,与对照组相比,甲醛注射模型组小鼠足组织中TNF-α和PGE2含量显著升高,MCP-1 mRNA表达量显著升高。阿司匹林和双姜胃痛丸中、高剂量均能显著降低甲醛注射足组织中TNF-α含量,阿司匹林和双姜胃痛丸低、中、高剂量均能显著降低甲醛注射足组织中PGE2含量和MCP-1mRNA表达量,且双姜胃痛丸的作用表现出剂量依赖性。具体见表4。

表4 双姜胃痛丸对甲醛致痛小鼠炎症反应的影响

2.4 双姜胃痛丸对甲醛致痛小鼠脑组织疼痛相关神经递质的影响 对甲醛致痛小鼠脑组织疼痛相关神经递质含量的结果见表5。结果显示, 甲醛致痛模型小鼠脑组织中5-HT含量较对照组升高,双姜胃痛丸高剂量对小鼠脑组织5-HT的含量有上调趋势,但无显著性差异。甲醛致痛小鼠脑组织中Glu含量与对照组相比无显著性差异,双姜胃痛丸各剂量对Glu含量无显著影响。阿司匹林对小鼠脑组织中5-HT和Glu含量均无明显影响。具体见表5。

表5 双姜胃痛丸对甲醛致痛小鼠脑组织疼痛相关神经递质的影响

3 讨论

傣药经方双姜胃痛丸由姜黄、紫色姜、地不容、石菖蒲、苦菜子组成,全方可理气止痛,和胃降逆。已有的研究证实,姜黄及其主要活性成分姜黄素[3-4],地不容及其主要活性部位总生物碱[5-6],均有确切的抗炎镇痛作用,但关于全方镇痛作用及机制的鲜有系统报道[7]。本研究分别选取热板法复制经典热刺激致痛模型,选取甲醛足底注射致痛法模拟急性组织损伤所致的持续性炎性疼痛,考察双姜胃痛丸的镇痛作用及其机制。其中,甲醛致痛模型Ⅰ相反应由于直接刺激外周神经所致,而Ⅱ相反应则主要由炎症介质产生和释放所致[8]。研究发现,双姜胃痛丸中剂量能提高热刺激小鼠的痛阈值,高剂量能缩短甲醛致痛小鼠的Ⅰ相舔、咬足时间,疼痛抑制率为28.38%;低、中、高剂量组均能显著缩短甲醛致痛小鼠的Ⅱ相舔、咬足时间,疼痛抑制率分别为21.39%、27.02%和42.42%,提示双姜胃痛丸既能通过抑制神经系统的活动产生镇痛效应,也能抑制炎症反应引发的炎性疼痛,且后者作用优于前者。

炎性疼痛可由创伤、感染、化学刺激(如甲醛、醋酸)、外科手术操作等导致的炎症反应所引发。在此过程中,包括粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、T细胞在内的多种免疫细胞活化并表达、释放出细胞因子、趋化因子及其他生理活性物质,如白介素(IL)-6、IL-1、TNF-α、MCP-1、PGE2等。其中,TNF-α和PGE2既是炎症介质,又是致痛物质,且PGE2增加可引起痛觉过敏和痛觉超敏发生[9-10]。趋化因子超家族成员MCP-1在炎症反应过程中大量产生,可通过诱导中枢敏化,在炎性疼痛的产生和维持过程发挥重要作用,对大鼠痛觉行为有易化作用[11]。本研究发现,双姜胃痛丸可明显降低小鼠甲醛注射后足组织中PGE2含量、TNF-α含量和MCP-1mRNA表达水平,提示双姜胃痛丸对甲醛致痛小鼠的Ⅱ相疼痛反应的抑制作用,与减少炎症介质、致痛物质及痛觉易化物质的产生和释放有关。单胺类神经递质和氨基酸类神经递质均参与中枢神经系统的镇痛行为,前者以5-HT、多巴胺等为代表,后者主要包含以Glu为代表的兴奋性氨基酸和以γ-氨基丁酸为代表的抑制性氨基酸[12-13]。本研究表明,双姜胃痛丸各剂量对小鼠大脑组织中5-HT和Glu含量无明显影响。

综上所述,双姜胃痛丸对热刺激致痛、甲醛致痛模型Ⅰ相疼痛反应和Ⅱ相疼痛反应均表现出镇痛作用,相同剂量下对甲醛注射引起的Ⅱ相疼痛反应的镇痛作用最强。在甲醛致痛模型,双姜胃痛丸显著降低甲醛注射组织中炎症介质、致痛物质PGE2和TNF-α含量,降低疼痛易化介质MCP-1的表达,而对脑组织中与中枢镇痛相关的单胺类神经递质5-HT和氨基酸类神经递质Glu均无明显影响,提示双姜胃痛丸的镇痛作用与减少炎症介质、致痛物质及痛觉易化物质的释放有关;双姜胃痛丸的镇痛作用是否会在更高剂量表现出对热刺激致痛及甲醛的致痛模型Ⅰ相反应阶段表现出剂量依赖性,以及其可能的作用机制,尚需进一步研究。

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