分散固相萃取-气相色谱-质谱联用测定茶叶中的28种农药残留

赵丽 农蕊瑜 师真

摘要：建立测定茶叶中28种农药残留量的气相色谱-质谱联用检测方法。茶叶样品经乙腈和正己烷提取后，采用分散固相萃取方法作前处理，以N-丙基乙二胺（PSA）、Bulk Carbograph、C18EC、MgSO4吸附并净化提取液中的干扰组分，净化液经气相色谱-质谱测定，以基质内标法定量。采用本试验建立的方法，在0.002～1.000 μg/mL 范围内，28种农药的线性关系良好，相关系数r>0.995，方法检出限为0.10～5.0 μg /kg，定量限为 0.30～15.00 μg /kg。0.075、0.375、0.750 mg/kg这3个添加量的平均加标回收率为63.9%～102.9%，相对标准偏差为2.05%～7.02%。与传统的QuEChERS法相比，该方法具有操作简单、快速，试剂用量少，回收率高，准确性强等特点。

关键词：茶叶;气相色谱-质谱法;农药残留;分散固相萃取

茶叶是我国的重要经济作物，也是出口贸易的重要组成部分。但茶叶在生长过程中易受到假眼小绿叶蝉、茶刺蛾、茶橙瘿螨等病虫害的污染，茶园杂草也会吸收肥料和水分，影响茶树的正常生长，为防治病虫害和排除杂草干扰，最常用的方法就是喷洒农药。而农药的过度使用已经影响到茶叶的品质和安全问题，农药残留超标已成为制约茶叶对外贸易的重要影响因素之一[1]。我国2017年6月18日起实施的GB 2763—2016《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中对茶叶中48种农药残留制定了限量要求，相比GB 2763—2014版增加了20种。因此，建立一种快速、准确度、高效的茶叶中农药残留检测方法尤为重要。为提高检测的准确度，有效可行的样品前处理方法尤为重要。

目前，国内外对于茶叶中农药残留检测的前处理方法主要有固相萃取（SPE）法[2-3]、QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）法[4-6]、基质固相分散萃取法[7-9]等。检测方法主要有气相色谱法[10-11]、氣相色谱-串连质谱（GC-MS/MS）法[12]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[13]法。本研究在现有文献的基础上，进一步优化前处理方法，全部前处理过程不须要进行溶剂换相和浓缩操作，以期为茶叶中多种农药残留的快速定量检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试茶叶为市购食品安全风险监测样品。

试剂：敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、灭线磷、乐果、甲基对硫磷、甲草胺、甲霜灵、毒死蜱、粉锈宁、除草醚、异菌脲、联苯菊酯、三氟氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、乙拌磷、艾氏剂、反-氯丹、α-硫丹、顺-氯丹、狄氏剂、β-硫丹、氯菊酯、阿特拉津（100 μg/mL）等，均购自中国计量科学研究院;乙腈、正己烷（色谱纯），购自美国赛默飞世尔公司;SPE N-丙基乙二胺（PSA） Packing（7.5 mg Bulk Carbograph，50.0 mg PSA，50.0 mg C18EC，150.0 mg MgSO4）净化剂（61.8 μmol/L），购自美国安捷伦公司;PSA净化剂（10～20 nmol/L）、石墨化炭黑（GCB）净化剂（120～400目）、MgSO4净化剂（50 μmol/L），均购自天津博纳艾杰尔公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000C气相色谱-质谱联用仪，电子天平（感量0.01 g），均质机，GM2000 Retsch涡旋机。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制 空白基质溶液：称取空白茶叶样品10.0 g，经提取、净化后，净化液置于4 ℃冰箱保存。

标准储备液：将1.00 mL 100 μg/mL的各试剂标准溶液转移到50 mL的容量瓶中，用正己烷定容，配制成质量浓度均为2.00 μg/mL的标准储备液，置于 4 ℃ 冰箱保存。

基质标准储备液：将0.10 mL 100 μg/mL的各试剂标准溶液转移到10 mL的容量瓶中，用空白基质溶液定容，配制成质量浓度均为1.00 μg/mL的基质标准储备液，置于4 ℃冰箱保存。

标准工作液：使用标准储备液，配制成质量浓度分别为0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000 μg/mL的系列标准工作液，待 GC-MS/MS检测。

基质标准工作液：使用基质标准储备液，配制成质量浓度分别为0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000 μg/mL的系列基质标准工作液，待GC-MS/MS检测。

内标工作液：将1.0 mL 100 μg/mL的阿特拉津内标溶液转移到5.0 mL的容量瓶中，用正己烷定容，配制成质量浓度均为20.0 μg/mL的内标工作液。

1.3.2 样品的制备 提取：称取混匀后的茶叶样品300 g，经均质机粉碎，装袋避光冷冻保存，备用。称取上述茶叶粉末2.00 g于10 mL离心管中，加入 60 μL 浓度为20.0 μg/mL的内标工作液、2.0 mL纯水、2.0 mL乙腈、3.0 mL正己烷充分混匀，涡旋振荡1 min，浸提10 min，再次涡旋振荡5 min，2 000 r/min 离心5 min，收集上清液，待净化。

净化：取提取后的上清液2.0 mL于 2 mL 净化管（7.5 mg Bulk Carbograph，50.0 mg PSA，50.0 mg C18EC，150.0 mg MgSO4）中，涡旋振荡1 min，10 000 r/min 离心5 min。取净化液经 0.45 μm 有机微孔滤膜过滤，待GC-MS/MS测定。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：DB-5石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）;进样口温度为 250 ℃;升温程序：100 ℃保持1 min，以40 ℃/min升至 160 ℃，保持0 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持 5 min，以8 ℃/min升至240 ℃，保持0 min，以 5 ℃/min 升至280 ℃，保持3 min，以30 ℃/min升至300 ℃，保持1 min;進样方式：不分流进样;进样体积为1 μL;载气为高纯度氦气，恒流模式，流量为 1.2 mL/min。

1.3.4 质谱条件 传输线温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃，电离方式为电离源（EI），电子能量为70 eV，溶剂延迟时间为3.5 min;采集模式：选择离子监测（SIM）和多离子监测（MRM）模式。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

分别采用SIM和MRM模式对所检测化合物进行扫描，并寻找到2种模式下化合物的扫描参数，同时建立2种扫描模式下化合物的检测质谱方法。为保证检测的精确度和准确度，且在MRM模式下所得的信噪比较SIM模式下的信噪比高，最终选择MRM模式对样品进行定量检测。2种扫描模式的质谱参数见表1。

2.2 样品前处理方法比较

方法一：称取茶叶粉末2.00 g于10 mL离心管中，加入60 μL浓度为20 μg/mL的内标工作液、2.0 mL 纯水、2.0 mL乙腈、3.0 mL正己烷充分混匀，涡旋振荡1 min，浸提10 min，再次涡旋振荡 1 min，2 000 r/min离心5 min，收集上清液，待净化。移取2.0 mL提取液置入装有7.5 mg Bulk Carbograph、50.0 mg PSA、50.0 mg C18EC、150.0 mg MgSO4的净化管中，振荡1 min后，静置5 min，净化液经0.45 μm有机微孔滤膜过滤，待GC-MS/MS分析。

方法二：称取茶叶粉末2.00 g于10 mL离心管中，加入60 μL浓度为20 μg/mL的内标工作液、4.0 mL 纯水、3.0 mL正己烷充分混匀，涡旋振荡 1 min，浸提10 min，再次涡旋振荡1 min，2 000 r/min 离心5 min，收集上清液，待净化。移取2.0 mL提取液置入装有7.5 mg Bulk Carbograph、50.0 mg PSA、50.0 mg C18EC、150.0 mg MgSO4的净化管中，振荡1 min后，静置5 min，净化液经 0.45 μm 有机微孔滤膜过滤，待GC-MS/MS分析。

以同一基质样品做添加0.2 mg/kg的标准浓度，分别按处理方法一、方法二进行前处理。经比较，由方法一提取的样品上清液颜色比方法二颜色深，但方法一的回收率高于方法二，其回收率比较见图1。因此，选择方法一作为本次样品的前处理方法。

2.3 提取溶剂的选择

农药残留量检测中常用的提取溶剂为乙腈、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、含1%乙酸的丙酮溶液、含1%乙酸的乙腈溶液等[14]。用乙腈提取时，茶叶提取液中的干扰组分最少，因此QuEChERS法普遍采用乙腈作为提取溶剂。乙腈极性较强，从而导致农药组分发生分裂，造成定量结果不准确。同时，用乙腈提取后直接进样，对色谱柱和检测器的损害较大，多次进样后，色谱峰发生不可逆拖尾。因此用乙腈提取时，常常须要采用浓缩、溶剂转换后才能进行检测，在一定程度上增大了农药在转换过程中的损失风险，且增大了工作人员的劳动量。因此，本试验选择乙腈和正己烷作为提取溶剂，并以上清液正己烷作为检测液，一方面能保证茶叶中的农药被充分提取，另一方面也避免了农药组分在浓缩、溶剂转换中的损失，更简化了试验步骤，也避免了浓缩、溶剂转换过程中由于试验人员的操作而引起的残留农药的损失。

2.4 基质效应考察

基质效应是农药残留检测中通常遇到的问题[11]，茶叶样品基质成分复杂，在气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱分析中，基质效应的存在不可避免，对于GC-MS/MS法测定农药残留通常有基质增强作用，而采用LC-MS/MS测定时，通常有基质抑制作用[12]，通常的解决办法有用空白基质配制标准曲线[10]、稀释法和加入保护剂法[11-12]。本研究配制了茶叶基质的基质标准溶液和同浓度的溶剂标准溶液，并对同一质量浓度均为 0.50 μg/mL 的标准工作液和基质标准工作液进行对比，对基质效应进行考察，试验中以ME=Slopi/Slopo评价基质效应，其中ME为基质效应，Slopi为基质匹配标准曲线的斜率，Slopo为纯溶剂标准曲线的斜率[15]，或者以如下公式进行计算：

基质效应=（基质标样峰面积-纯溶剂标样峰面积）/纯溶剂标样峰面积×100%。

基质干扰的大小即基质效应在80%以下视为强基质抑制效应，在80%～120%之间视为弱基质效应，在120%以上视为强基质增加效应[16-22]。基质效应结果见表2，浓度为0.50 μg/mL的响应值比较见图2。通过试验发现，在所检测的28种农药中，仅有8种农药的基质效应在80%～120%之间，属弱基质效应，其余都出现基质效应增强的趋势。试验采用基质匹配校准曲线对样品中的农药进行定量分析，对基质效应进行补偿，用以抵消基质效应的影响。

2.5 净化剂种类及用量的选择

茶叶中含有大量的色素、生物碱、甾醇、多酚类、水分等干扰物质。其中，水分会影响检测器的正常检测，并会对色谱柱的固定相造成化学损伤;茶多酚类物质是茶叶中的最主要干扰成分;叶绿素是茶叶中最直接可见的色素类干扰成分。因此，本研究在2 mL净化管中加入7.5 mg Bulk Carbograph、50.0 mg PSA、50.0 mg C18EC、150.0 mg MgSO4或150 mg PSA、45 mg GCB、900 mg MgSO4。对比2种净化剂对提取液中茶多酚和叶绿素的净化能力，通过分析，采用第一种净化剂净化后，28种农药的回收率的确比后者高，且净化后的样品颜色更浅。因此，采用第一种净化方式进行净化。

2.6 内标的选择

在茶叶基质干扰下，农药在前处理过程中易被吸附、降解和损失，因此采用内标法定量可以提高定量结果的准确性，本试验以阿特拉津作为内标物进行定量分析。

2.7 方法的线性范围和检出限、定量限

本试验用红茶作为空白样品，按“1.3.2”节制备基质提取液，并用基质提取液配制标准工作曲线序列。各种目标化合物响应值不同，在一定的含量范围内线性关系良好，相关系数r≥0.995。以3倍信噪比时对应的含量定位方法的检出限，为0.10～5.00 μg/kg;以10倍信噪比时对应的含量定位方法定量限，为0.30～15.00 μg/kg，方法的线性方程、检出限及定量限见表3。

2.8 方法的精密度和准确度

以样品空白进行高、中、低不同水平添加各试剂，平行6次试验，得到加标回收率为63.9%～102.9%，相对标准偏差（RSD）为2.05%～7.02%;其精密度和准确度可以满足分析要求，加标结果见表4。

2.9 实际样品测定

应用建立的分析方法对红茶、绿茶2个类别30件样品进行农药残留检测，发现在绿茶和红茶中均检出甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、联苯菊酯、氯菊酯、乙拌磷、甲基对硫磷等农药残留的样品，图3为绿茶中检出残留农药的多反应监测色谱图。

3 结论

本试验采用乙腈和正己烷共同作为提取溶剂，并以上清液正己烷作为检测溶液，经Bulk Carbograph、PSA、C18EC和MgSO4混合净化剂净化，以GC-MS/MS法检测，建立了检测茶叶中28种农药残留的气相色谱-质谱联用方法。本试验的方法与传统的提取方法相比，可直接使用正己烷进行提取进样，前处理更为方便，并减少了溶剂转换过程中农药成分的损失，提高了回收率。本试验的方法操作简便、快速、准确可靠，可以用作茶叶中多种农药残留量的检测方法。

参考文献：

[1]荣杰峰，韦 航，黄伙水，等. 茶叶农药残留检测的前处理新技术进展[J]. 分析测试学报，2016，35（1）：8-12.

[2]Saito-Shida S，Nemoto S，Teshima R，et al. Multiresidue determination of pesticides in tea by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Environmental Science & Health Part B，2015，50（11）：760-776.

[3]Hayward D G，Wong J W，Park H Y，et al. Determinations for pesticides on black，green，oolong，and white teas by gas chromatography triple-quadrupole mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2015，63（37）：8116-8124.

[4]潘胜东，叶美君，陈晓红，等. QuEChERS净化-超快速液相色 谱- 串联质谱法同时检测茶叶中常见的杀虫剂残留[J]. 卫生研究，2018，47（5）：809-814.

[5]崔 鹏，马 晶，孙 谦，等. GC-MS/MS结合改进的QuEChERS方法测定茶叶中多农药残留[J]. 环境化学，2018，37（5）：1175-1178.

[6]张秀丰，翟硕莉，杨亚君，等. 改良的QuEChERS-气相色谱-质谱联用法测定茶叶中多种农药残留[J]. 分析实验室，2018，37（5）：524-528.

[7]李 玮，贾彦博，林伟杰，等. 分散固相萃取净化-气相色谱-质谱联用法测定茶叶中7种杀螨杀虫类农药残留[J]. 食品安全质量检测学报，2017，8（9）：3485-3490.

[8]谭 君，文 洋，谭 斌，等. 茶叶中有机氯和拟除虫菊酯同时分析的简易前处理方法研究[J]. 现代食品科技，2017，33（2）：223-229.

[9]刘家曾，宋宁慧，王艺璇，等. 基质固相分散-气相色谱/质谱联用技术测定茶叶中8种农药残留[J]. 分析科学学报，2018，34（3）：337-341.

[10]黄田田，汤 桦，董晓倩，等. 多壁碳纳米管QuEChERS-气相色谱法测定茶叶中23种有机磷农药残留量[J]. 食品科学，2018，39（6）：315-321.

[11]陈兴连，邵金良，方海仙，等. 气相色谱法同时快速测定茶饮料及其制品中17种有机氯、拟除虫菊酯农药残留[J]. 食品安全质量检测学报，2018，9（6）：1275-1283.

[12]高艺羡，陈萍虹，聂丹丹，等. 气相色谱-串联质谱双内标法测定茶叶中53种农药残留[J]. 色谱，2018，36（6）：531-540.

[13]黄超群，黄 雪，吴 娟，等. 多壁碳纳米管分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定茶叶中5种烟碱类农药的残留[J]. 2018，54（5）：584-590.

[14]赵小云，谢德芳. 超高效液相色谱-串联质谱对香蕉中苯醚甲环唑和噻呋酰胺农药残留的检测[J]. 江苏农业科学，2019，47（2）：181-185.

[15]周 利，罗逢健，张新忠，等. 纳米竹炭分散固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定绿茶中的农药多残留[J]. 分析测试学报，2014，33（6）：642-647.

[16]朱炳祺，金绍强，徐潇颖，等. 改进的QuEChERS方法结合在线凝胶色谱-气相色谱-串联质谱法测定茶叶中39种有机磷农药的含量[J]. 理化检验（化学分册），2018，54（4）：433-442.

[17]张东飞，邹金梅，张朝晖，等. 液相色谱-串联质谱法测定茶叶中的11种农药残留[J]. 食品安全质量检测学报，2018，9（2）：294-298.

[18]Li Y，Chen X，Fan C L，et al. Compensation for matrix effects in the gaschromatography-mass spectrometry analysis of 186 pesticides in tea matrices using analyte protectants[J]. Journal of Chromatogr A，2012，1266：131-142.

[19]Oellig C，Schwack W. Planar solid phase extraction clean-up for pesticide residue analysis in tea by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatogr A，2012，1260：42-53.

[20]张利强，程盛华，李 琪，等. 气相色谱法测定谷物中9种有机磷农药残留量的基质效应[J]. 理化检验（化学分册），2016，52（2）：136-140.

[21]Lópezfernández O，Rialotero R，Gonzálezbarreiro C，et al. Surveillance of fungicidal dithiocarbamate residues in fruits and vegetables[J]. Food Chem，2012，134（1）：366-374.

[22]周 利，羅逢健，张新忠，等. 纳米竹炭分散固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定绿茶中的农药多残留[J]. 分析测试学报，2014，33（6）：642-647.张 轩，李志伟，郑德聪，等. 基于模糊PID两轮拖拉机控制系统抗干扰分析[J]. 江苏农业科学，2020，48（12）：216-222.