不同预处理方式对红枣环磷酸腺苷提取率的影响

贾文婷 杨慧 吴洪斌

摘要：环磷酸腺苷（cAMP）是机体内一种重要的生理活性物质，能调节机体细胞的多种功能活动，开发利用前景广阔。以新疆地区红枣为原料，采用超微粉碎法和真空冷冻干燥法对红枣进行预处理，通过响应面法建立了水浴提取环磷酸腺苷的二次多项数学模型，优化提取工艺参数，通过比较2种不同的预处理方式，得到的结果如下：超微粉碎法处理后cAMP提取率为318.31 μg/g，真空冷冻干燥处理后cAMP提取率为239.35 μg/g。

关键词：新疆红枣;环磷酸腺苷;提取;超微粉碎法;真空冷冻干燥法;响应面分析

环磷腺苷（cAMP）是细胞内的重要物质，参与调节物质代谢，是生命信息传递的“第二信使”[1-2]。它在动物体内可以增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和缺氧能力，是动物体内一种广泛存在的、具有生理活性的重要物质[3-5]。目前，红枣中cAMP的含量是已知植物中最高的，随着红枣深加工及副产物综合利用产业化的发展以及医疗和保健行业对cAMP需求量的增大，使用不同方法从红枣中提取cAMP的研究越来越多，因此，深入研究如何高效、低耗、环保地从红枣中提取cAMP具有重要意义[6]。

本研究以新疆地区红枣为原料，采用超微粉碎法、真空冷冻干燥法2种不同方式进行预处理，水浴法提取cAMP，通过单因素及响应面试验，利用 Design-Expert中BBD统计软件，以红枣cAMP提取率为响应值，获得2种预处理方式的最佳工艺，并通过高效液相色谱法测定其提取率，以期为提高cAMP提取率提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

红枣，购自新疆石河子市农贸市场。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 超微粉碎机、真空冷冻干燥机、烘箱、高效液相色谱仪、电子天平、台式低速离心机、数显恒温水浴锅、旋转蒸发器。

1.2.2 试剂 cAMP标准品（纯度>99%）、甲醇（色谱纯）、磷酸二氢钾（优级醇）、果胶酶、纤维素酶。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取cAMP标准品，加适量蒸馏水制成15 μg/mL的溶液，摇匀，经 0.45 μm 的滤膜过滤即得对照品溶液[7]。

1.3.2 样品的制备 精密称取采用不同预处理方式处理后的枣粉10.00 g，加入440 mL超纯水，于90 ℃下水浴提取2次，每次1 h，合并提取液，于离心机中3 000 r/min离心15 min，取上清液减压浓缩至100 mL，过0.45 μm微孔滤膜[8]，得样品溶液。

1.3.3 色谱条件 ZORBAX SB-Aq C18色谱柱（3.5 μm，4.6 mm×150 mm），柱溫为30 ℃，以 V水 ∶ V乙腈=40 ∶ 60）为流动相，流速为0.6 mL/min，进样量为5 μL。

1.3.4 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），正离子检测，雾化气（N2）压力设为0.28 MPa;干燥气（N2）的流速设为10 L/min，干燥气（N2）的温度设为350 ℃。多反应监测（MRM）模式监测反应质荷比（m/z）为330.10～136.00。碎裂电压为140 V;碰撞能量为25 V。

1.3.5 制作标准曲线 取“1.3.1”节中配制的cAMP对照溶液，加超纯水配制成1.00 mg/mL的混合储备液，于4 ℃保存;使用时用超纯水稀释，配制成cAMP质量浓度为0.01、1、10、50、100、500、1 000 ng/mL 的混合对照品溶液[9]。标样图谱如图1所示。

2 结果与分析

2.1 超微粉碎法最佳工艺

2.1.1 单因素试验结果 影响红枣超微粉碎的主要参数有物料水分含量（%）、单次打粉时间（s）、打粉次数（次）。分别对这几个参数进行单因素试验，（1）在单次打粉时间为10 s、打粉次数为5次的条件下，分别测定物料含水量为6%、8%、10%、12%、14%时的cAMP提取率;（2）在物料含水量为10%、打粉次数为5次的条件下，分别测定单次打粉时间为8、10、12、14、16 s时的cAMP提取率;（3）在物料含水量为10%、单次打粉时间为10 s的条件下，分别测定打粉次数为1、3、5、7、9次时的cAMP提取率。从表1可以看出，cAMP提取率随物料含水量的增加先增大后减小，在物料含水量为10%时达到最大值;cAMP提取率随单次打粉时间的增加先增大后减小，在单次打粉时间为10 s时达到最大值;cAMP提取率随打粉次数的增加先增大后减小，在打粉次数为5次时达到最大值。因此，选择物料含水量为8%、10%、12%，单次打粉时间为5、10、15 s，打粉次数3、5、7次进行响应面分析。

2.1.2 响应面优化结果 根据前期单因素试验的结果，选取物料水分含量（A）、单次打粉时间（B）、打粉次数（C）作为自变量，产品的cAMP提取率（Y1）作为因变量，进行二次回归正交旋转组合试验，各因子的水平设置及编码值见表2。

利用Design-Expert软件设计试验方案，试验设计及结果见表3。

2.1.3 响应面结果分析 应用Design-Expert 7.0.0 软件进行多元回归拟合，得到的模拟回归方程为：

响应面的回归显著性方差分析结果见表4，可以看出，该回归模型具有极显著性（P<0.000 1），失拟项（P=0.100 2>0.05）不显著，相关系数R2=0.989 5，大于0.9，说明模型相关度较好[10]。分别以物料水分含量、单次打粉时间、打粉次数作响应面与等高线分析，由图2至图4可知，打粉次数（C）对环磷酸腺苷提取率的影响较大，表现为对应曲线较陡;物料水分含量（A）和单次打粉时间（B）对应曲线较平缓，表明它们对环磷酸腺苷的提取效果影响较小，这与回归分析的结果（表4）相吻合。