基于SLAF-seq技术的山西省地方梨品种的SNP分析

白牡丹，郝国伟，张晓伟，杨 盛，郭黄萍

(山西省农业科学院 果树研究所/果树种质创制与利用山西省重点实验室，太原 030031)

山西省是中国梨的主要产区之一，栽培范围广，在栽培过程中已演化出丰富的梨种质资源，如‘金梨’‘黄梨’‘小白梨’和‘油梨’等品质优良的地方品种。了解这些地方梨品种的群体结构和亲缘关系，对山西省梨资源的搜集、保护及利用都具有重要的指导意义。

目前，DNA分子标记技术已广泛应用于物种进化分类、基因组研究、遗传学和分子分类学等许多研究领域[1-4]。其中，以SNP为代表的第三代分子标记技术，在分子遗传图谱构建、遗传多样性与种质鉴定、重要性状相关基因的定位和分子标记辅助选择等农作物育种领域发挥着重要作用[5-7]。SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)是特异性位点扩增片段测序技术的简称，该技术降低了基因组的复杂度，并且不依赖基因组序列，成为SNP标记开发的首选。相对于传统的技术，SLAF-seq技术不仅节省测序成本和时间，而且在有参考基因组生物和无参考基因组生物中都可以广泛应用[8-9]。

本研究拟通过简化基因组技术SLAF-seq，对山西省30份地方梨品种资源进行高通量测序，鉴定SNP，并利用获得的SNP数据进行群体多样性分析，包括进化树分析、群体结构分析及群体特异SNP标记的开发。这将为山西省地方梨种质资源的科学利用、品种选育、果树生产及分子标记辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以山西省农业科学院果树研究所梨资源圃搜集到的山西省各地区的30份地方梨品种为试材(表 1)。

1.2 基因组DNA 制备

2018年4月下旬，采集幼嫩的梨叶片做标记置于液氮中带回室内，放至超低温冰箱中，备用。采用CTAB法提取基因组 DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳和ND-1000分光光度计检测基因组 DNA的质量及浓度。按照高通量测序的要求，每样品的DNA浓度达到30 ng·L-1，样品纯度OD260/280分布在1.8～2.0之间，电泳结果主带清晰，无 降解。

1.3 酶切方案的设计和Illumina HiSeq测序

选取梨(Pyrus)基因组作为参考基因组进行酶切预测，梨基因组大小约为512 Mb，GC含量为37.29%(http://peargenome.njau.edu.cn/default.asp?d=4&m=2)。利用SLAF酶切预测软件对参考基因组进行酶切预测，选择最适的酶切方案。同时，选用日本晴水稻作为对照进行评估酶切方案的准确性。

根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品基因组DNA分别进行酶切，对SLAF标签(酶切片段长度为264～314 bp的序列)进行3′端加A处理、PCR扩增和切胶选取目的片段等过程，文库质检合格后用Illumina HiSeq XTen进行测序[10]。

1.4 群体遗传分析

利用Dual-index对测序得到的原始数据进行识别，得到各个样品的序列(reads)，过滤、接头后对测序质量和数据量进行评估[11]。SLAF标签的获得和SNP标记的开发参照段义忠等[12]的方法。一般MAF>0.05的SNP在群体分析中被认为是有代表性的SNP。筛选出的有代表性的SNP通过Admixture[13]软件分析群体结构，通过MEGA5[14]软件结合neighbor-joining算法进行进化分析。

表1 山西省地方梨品种原始地理分布信息Table 1 Original geographic distribution of local pear germplasm in Shanxi

2 结果与分析

2.1 简化基因组序列的产出和质量评估

对梨(Pyrus)参考基因组进行电子酶切预测，最终确定使用RsaⅠ+HaeⅢ酶切，预测到100 227个SLAF标签，在基因组上基本分布均匀，酶切方案可行。试验中，对照基因组(水稻)测序获得0.22百万序列(MReads)的数据量。从30个梨地方品种共获得83.79 Mreads数据，测序平均Q30为96.33%，平均GC含量为38.90%(表2)。Q30数据表明测序质量高，测序结果 可靠。

表2 各样品测序数据统计Table 2 Statistics for sequencing data

2.2 SNP 分子标记的鉴定

通过序列分析，从30个地方梨品种中共获得603 177个 SLAF 标签，并鉴定到多态SLAF标签320 703个。通过分析多态SLAF标签，鉴定到2 140 079 个 SNP标记，每个样品的SNP数目从802 818至1 310 957不等，这些SNP的平均完整度为37.51%～61.26%。分析SNP 可以看到，不同样品的 SNP 杂合率为10.98%～ 18.39%，它们之间存在一定差异，表明梨样品基因组的杂合度很高(表3)。

2.3 群体遗传分析

基于筛选出的有效 SNP，采用 Admixture 软件计算了30个山西省地方梨品种的群体结构。从图 1 可见，当K为 2 时，交叉验证错误率最低，拥有最低交叉验证错误率的分群数为最优分群数，所以，30个梨品种大致可以分为两大类。‘小白梨’‘红肖梨’‘海桃’‘硕丰梨’‘金梨’‘马蹄黄’‘砀山黄’‘佛见喜’‘水红肖’‘铁梨’‘金梨变’‘笨梨’‘晋蜜梨’‘玉酥梨’‘晋早酥’‘玉露香梨’和‘甘子梨’来自于第一个原始祖先的可能性较大；‘香水梨’‘油梨’‘原平红’‘肖梨’‘车头梨’‘锤梨’‘晋酥梨’‘隰县甜梨’‘酸圪卢’‘晋城夏’‘大黄梨’‘白肖梨’和‘兔头红’来自于第二个原始祖先的可能性较大。

表3 SNP统计Table 3 Statistics of identified SNPs

利用SNP标记信息，对30份地方梨品种进行聚类分析(图 2)，在相似系数0.911处，所有梨种质聚为4个组。第一组包括3份种质，分别为‘小白梨’‘红肖梨’和‘海桃’，前者为白梨，后两者为秋子梨。第二组有1份种质‘硕丰梨’，原产地山西太谷。第三组包括12份种质，在相似系数0.946处，可以划分为3个亚组，第1亚组包括1份种质‘金梨’；第2亚组包括‘马蹄黄’和‘砀山黄’2份种质，起源地不确定；第3亚组包括9份种质，每个品种都有不同的分支，原产地各不同。第4组包括14份种质，在相似系数0.95处，可以划分为2个亚组，第1亚组包括3份种质，‘晋蜜梨’‘玉酥梨’和‘晋早酥’的原产地在山西太谷；第2亚组包括11份种质，其中‘玉露香梨’ ‘晋酥梨’的原产地为山西太谷，‘车头梨’‘锤梨’和‘甘子梨’的原产地为山西永济，其他均在山西高平和晋城。另外，‘马蹄黄’与‘砀山黄’在田间性状上比较相似，在进化树上显示两者亲缘关系较近，推断二者可能属于同种不同名；‘金梨’与‘大黄梨’在田间性状上比较相似，在进化树上显示两者亲缘关系较远，可以断定二者为不同梨品种。

图1 K值对应的交叉验证错误率Fig.1 Admixture validation error rate corresponding to K value

图2 梨品种的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of pear varieties

3 讨 论

3.1 简化基因组技术在果树分子标记开发上的可行性及优势

目前，主要的简化基因组测序技术有，基于限制性核酸内切酶的测序技术(RAD-seq)、基因分型测序技术(GBS)、基于IIB 型限制性核酸内切酶的测序技术(2b-RAD)和特异性长度扩增片段测序技术(SLAF-seq)[15-18]。这些技术只对酶切片段进行测序，可大幅降低基因组的复杂度，不受参考基因组的限制，操作简便，可进行大规模SNP标记的开发和分析。本试验运用 SLAF-seq 技术，在山西省30份地方梨品种中共获得83.79 MReads，开发了603 177个SLAF 标签，其中多态性 SLAF 标签320 703个，从中鉴定到 2 140 079个SNP，利用有效的SNP标记分析了相应梨品种的群体结构和系统发生树，为山西省地方梨品种的亲缘关系提供依据。

3.2 山西省地方梨种质资源聚类及亲缘关系 分析

遗传多样性评价对种质资源的保护和有效利用具有重要意义。在梨属种质资源研究中，曲柏宏等[19]利用RAPD技术把40个梨品种和类型划分为7类。赵国芳[20]利用ISSR分子标记技术对四大栽培系统具有典型代表性的25个栽培梨品种进行聚类,得出白梨系统与秋子梨系统亲缘关系较近,其次与砂梨系统亲缘关系较近，与西洋梨系统亲缘关系较远。岳晓燕等[21]选用17对SSR引物对福建的49个梨样品的遗传多样性进行分析，基于Nei和Li的遗传距离的邻接法将所有地方品种划分为9个组。Song等[22]利用134个SSR标记将99个梨品种的遗传结构进行分析，结果表明日本梨与中国梨亲缘关系密切。张小双[23]将244份中国北方地方梨品种和野生资源聚类为4组，且聚类分析结果与地理位置相关。本试验利用SNP标记把30份山西地方梨品种聚类为4大组，聚类分析结果与地理位置没有明显的关系，与Cao等[24]的研究结果不同。大多数地方梨品种聚到第4组，说明山西地区的梨种质亲缘关系较近，地方梨品种的更进一步归类应该结合果实性状进一步研究。

3.3 山西省地方梨种质资源的鉴定与利用

山西省地方梨种质资源的遗传多样性丰富，在品种改良和选育的过程中，保证品种的真实性和纯度不容忽视。生产上，一般采用形态性状进行梨品种鉴定，鉴定周期长、准确性较低。梨为多年生木本植物，童期长，很多品种在苗期的形态差异较小，利用传统的形态性状等方法难以区分各个品种[25]。在本研究中，利用SNP标记可以快速客观地鉴定出在田间性状比较相似的品种，如‘金梨’与‘大黄梨’为不同梨品种，‘马蹄黄’和‘砀山黄’可能属于同种不同名，但仍需进一步试验验证。今后也可以利用亲缘关系较远的品种进行配置杂交组合。