微生物复合发酵剂对香肠的食用安全性分析

田甜，张雅琳，潘攀，孙劲松，王新惠*，刘洋

1. 成都农业科技职业学院（成都 611130）；2. 成都大学肉类加工四川省重点实验室（成都 610106）

香肠具有悠久的历史，中国传统的香肠依靠的是自然环境中的微生物进行发酵，而在德国、意大利等国家制作的香肠是有添加微生物发酵剂，并且发酵香肠较传统香肠具有较高质量。近几年，香肠作为消费者喜爱的发酵食品，其食用安全性受到关注，因为在自然发酵环境中会有某些有害微生物会产生有害物质，从而对人体健康造成伤害，如组胺会导致人体产生晕厥、呕吐等急性中毒症状，残留的亚硝酸盐可以和胺类物质生成亚硝胺，从而诱发胃部等发生癌变。研究学者发现通过添加微生物发酵剂，不仅可以改善香肠的品质，还可以提高香肠的安全性，李婧等[1]在香肠中接种清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei），发现香肠的感官性提高，并且有害物质减少；Corral等[2]发现接种汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）可以弥补因为低盐低脂给香肠带来的感官上的缺点。Cavicchioli等[3]和孙燕菲等[4]发现戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）在发酵食品中能抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）等有害微生物的生长。

试验加入复合发酵剂，由清酒乳酸杆菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）制成，并且由自然发酵的香肠作为对照组进行对比，研究复合发酵剂对香肠的理化指标和安全性指标的影响，旨在为提高传统香肠的食用安全性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原辅料

卫生检疫合格的新鲜猪肉、肠衣、食用级食盐、味精、蔗糖等均购于成都龙泉驿区成都大学十陵鑫大百货超市。

1.2 复合发酵剂

清酒乳酸杆菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）均由肉类加工四川省重点实验室从自然发酵的香肠中分离获得，5种菌以1∶1∶1∶1∶1比例制作成冻干粉。

1.3 主要试剂

磷酸组胺标准品和衍生剂丹磺酰氯（Sigma公司）；乙腈（Bessldorf公司）；正丁醇、甲醇、三氯甲烷、乙酸、乙酸铵、丙酮、三氯乙酸、氢氧化钠、乙醚、氯化钠、盐酸、亚硝酸钠、谷氨酸钠、亚铁氰化钾、氢氧化钾、酚酞、乙醇、乙酸锌、对氨基苯磺酸等（均为国产分析纯，成都市科隆化学品有限公司）。

1.4 主要仪器与设备

Testo 205肉类专用pH计（德国仪表国际贸易（上海）有限公司）；JA3103N电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；RC-III-20L超纯水机（成都瑞昌仪器制造有限公司）；HD-3A型智能水分活度仪（无锡市华科仪器仪表有限公司）；DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；721可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；LD-5离心机（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

1.5 香肠制作

1.5.1 香肠配方

瘦肉与肥肉比例为3∶1，其他辅料比重按照肉的质量为蔗糖0.3%、盐2.6%、水5%、葡萄糖0.4%、NaNO2150 mg/kg、抗坏血酸（维生素C）0.06%、添加复合发酵剂0.04%，不添加其他香辛料。

1.5.2 工艺流程

原料肉→修整→腌制→绞碎→拌料→灌肠→发酵→成熟

1.5.3 操作要点

将猪肉切成1.5～2.0 mm左右同样大小的肉丁，将切好的肉丁在冰箱冷藏室（3～7 ℃）冷藏24 h，加入调料，混合均匀后在低温下腌制24 h；直投入冻干复合发酵剂，接种量0.04%，采用手工灌肠，每节香肠约10 cm，用针扎香肠中气泡；灌好的香肠挂放在恒温恒湿发酵箱中，控制发酵温度在20～25 ℃之间，相对湿度在91%～96%之间，进行发酵3 d，控制温度在16～18 ℃之间，相对湿度在75%～80%之间，直到香肠成熟，以自然发酵为对照。

1.6 试验方法

1.6.1 pH的测定

采用德国Testo 205 pH计肉类专用穿刺电极插入香肠前、中、后部，重复测定3次，取平均值。

1.6.2AW值的测定

取香肠前、中、后3部分的肉进行切碎，并且混匀，每次称取5 g肉平铺在水分活度仪测定盒的底部，称定3次，取平均值。

1.6.3 酸价的测定

参照GB/T 5009.37《食用植物油卫生标准的分析方法》[5]测定香肠中的酸价。

1.6.4 亚硝酸盐的测定

依据GB/T 5009.33—2011[6]的方法测定香肠中亚硝酸盐含量。

1.6.5 组胺的测定

参考王新惠等[7]的方法测定香肠中的组胺含量。

1.7 数据分析

每个样品做3次平行检测。数据分析采用Matlabver.2006b和Microsoft Excel。所有数据由平均值±标准偏差组成。

2 结果与分析

2.1 复合发酵剂对香肠pH的影响

自然发酵香肠和接种复合发酵剂香肠的pH随着时间变化如图1所示。结果表明，自然发酵香肠和接种复合发酵剂香肠的pH随着时间先降低后升高，最后再降低。在发酵初期，接种复合发酵剂香肠的pH下降的速度和时间比对照组快，是因为复合发酵剂中有戊糖片球菌和清酒乳酸杆菌，可以利用碳水化合物产生大量乳酸[8]，发酵环境中的微生物发酵剂在前期快速增长，所以导致发酵环境的pH迅速下降。在发酵后期，自然发酵香肠和接种复合发酵剂香肠的pH均有所上升，可能的原因是低pH发酵环境虽然会抑制有害微生物增长，但是也会影响乳酸菌代谢，并且发酵环境中的蛋白质分解生成的碱性物质对发酵环境的酸有一定缓冲作用，所以发酵环境中的pH有短暂上升趋势。

从图1可知，在第18天时，自然发酵香肠的pH 5.34，而接种复合发酵剂香肠的pH 5.14，接种复合发酵剂香肠的pH比自然发酵香肠的pH低3.75%。pH是属于防止食品腐败的栅栏因子，在传统香肠中检测出有发光杆菌属（Photobacteriumspp.）、环丝菌属（Brochothrixspp.）和假单胞菌属（Pseudomonasspp.）等几种腐败菌属[9]，所以降低香肠的pH不仅可以抑制腐败菌生长，也可以降低发酵环境中酶活性，有利于提高香肠的食用安全性、增长其贮藏期。

图1 复合发酵剂对香肠pH的影响

2.2 复合发酵剂对香肠AW的影响

自然发酵香肠和接种复合发酵剂香肠的AW值随着发酵时间变化如图2所示。自然发酵香肠和接种复合发酵剂香肠的AW值均随着时间而降低，在发酵后期，接种复合发酵剂香肠的AW值比自然发酵香肠降得更低，Nie等[10]和Aro等[11]发现戊糖片球菌、清酒乳杆菌和肉葡萄球菌可以加强蛋白酶活性，从而加强蛋白质的水解，蛋白质结构被破坏，导致蛋白质的保水性降低，所以接种复合发酵剂香肠的AW值低于自然发酵香肠的AW值。

从图2可以看出，在第18天时，自然发酵香肠的AW值是0.828，而接种复合发酵剂香肠的AW值是0.806，接种复合发酵剂香肠的AW值比自然发酵香肠低2.66%，发酵环境中的AW值的降低不仅会影响许多腐败菌的生长[12]，并且还可以影响许多需要水参与的生化反应。生活中的面粉、奶粉等产品就是依靠降低AW值而增加贮藏期和抑制有害微生物生长，从而提高食用安全性，可见AW值对食品保藏和食品安全的重要性。结果表明，对香肠添加复合发酵剂会提高香肠的微生物安全性。

图2 复合发酵剂对香肠AW的影响

2.3 复合发酵剂对香肠酸价的影响

自然发酵香肠和接种复合发酵剂香肠的酸价随着发酵时间变化如图3所示。结果表明，试验组和对照组的酸价均随着时间而增加，但是接种复合发酵剂的香肠酸价始终低于自然发酵的香肠。脂肪的氧化分为2步，第1步是脂肪的水解过程，脂肪水解成游离的脂肪酸，第2步是脂肪酸被氧化成醛、酮等小分子物质，而香肠的风味主要来源于这些酯、酮分子。在复合发酵中的汉逊德巴利酵母能加强香肠的风味，可以产生酯、醇和酮类等风味物质，并且研究发现，汉逊德巴利酵母也可以抑制香肠的氧化和酸败[13]。复合发酵剂中的肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌能帮助香肠产生良好风味[14]。香肠适度的脂肪氧化能带来风味，但是氧化过度，不仅会影响香肠感官，也会造成食物浪费。

从图3可以看出，自然发酵香肠在发酵结束时酸价是1.41 mg/kg，而接种复合发酵剂香肠在发酵结束时酸价是1.34 mg/kg，接种复合发酵剂香肠酸价比自然发酵香肠的酸价低4.96%。因此，添加复合发酵剂可以降低香肠的过度氧化情况出现，并且可以赋予香肠良好风味。

图3 复合发酵剂对香肠酸价的影响

2.4 复合发酵剂对香肠亚硝酸盐残留量的影响

自然发酵香肠和接种复合发酵剂香肠中的亚硝酸盐残留量随着发酵时间变化如图4所示。结果表明，2种香肠的亚硝酸盐残留量均先升高后再降低。在第8天时，2种香肠的亚硝酸盐残留量达到最大值，刚开始亚硝酸盐的残留升高的原因可能是整个发酵环境都是在开放环境，在起始的发酵环境中由于菌群结构复杂，杂菌也会很多，所以发酵环境中的杂菌将硝酸盐转化成亚硝酸盐，香肠中亚硝酸盐的残留量是呈增加的趋势。在后期，亚硝酸盐的残留量降低的原因可能是环境中pH下降，抑制杂菌代谢，并且亚硝酸盐在酸性条件下可以生成亚硝酸，从而与肌红蛋白反应，最后发酵环境中的亚硝酸盐的残留量降低。复合发酵剂中的清酒乳酸杆菌可以降低亚硝酸盐的残留[15]，有研究学者发现木糖葡萄球菌的过氧化氢酶能将亚硝酸盐分解成为氨[16]。所以在发酵后期，香肠中的亚硝酸盐残留量降低，并且添加复合发酵剂香肠的亚硝酸盐残留量低于自然发酵香肠。

从图4可知，自然发酵香肠最后的亚硝酸盐残留量是1.56 mg/kg，而接种复合发酵剂香肠亚硝酸盐残留量是1.08 mg/kg，接种复合发酵剂香肠亚硝酸盐残留量比自然发酵香肠低30.77%。亚硝酸盐因为具有抑菌、抗氧化和着色等功能被广泛使用，但是亚硝酸盐能和次级胺生成亚硝胺，亚硝胺会诱发癌症，尤其是在胃部[17]。可以看出，添加复合发酵剂可以降低亚硝酸盐在香肠中的残留量，有利于提高香肠的食用安全性。

2.5 复合发酵剂对香肠组胺含量的影响

自然发酵香肠和接种复合发酵剂香肠的组胺含量随发酵时间变化如图5所示。结果表明，自然发酵和接种复合发酵剂香肠的组胺含量均为先升高后降低。组胺的形成必须要有前体物质，游离的组氨基酸，还必须要有能产生氨基酸脱羧酶的微生物，研究学者在香肠、调味品以及鱼肉等产品中均发现组胺的存在[18-19]。初始阶段，香肠内组胺含量升高，可能是因为发酵环境中菌群较复杂，再加上香肠富含蛋白质，蛋白质分解产生游离的组氨基酸，发酵环境中的杂菌产生组氨基酸脱羧酶作用于组氨基酸，所以前期的组胺含量快速增长。但在后期，因为乳酸菌增长，导致发酵环境pH下降，影响氨基酸脱羧酶的活性和杂菌的生长代谢，所以组胺增长得到抑制，并且香肠中有许多微生物可以产生组胺降解酶而减少组胺含量。复合发酵中的清酒乳酸杆菌和木糖葡萄糖球菌可以降低香肠中的组胺[20]，所以在后期，添加复合发酵剂香肠中的组胺含量会低于自然发酵香肠。

从图5可知，自然发酵香肠在发酵结束时组胺含量为1.72 mg/kg，接种复合发酵剂香肠在发酵结束时组胺含量是1.43 mg/kg，接种香肠比自然发酵香肠的组胺含量低16.86%。组胺是生物胺中危害性较强的，并且在发酵食品中组胺是常见生物胺，结果表明，在香肠中添加复合发酵剂可以减少组胺生成，提高香肠的食用安全性。

图4 复合发酵剂对香肠亚硝酸盐含量的影响

图5 复合发酵剂对香肠组胺含量的影响

3 结论

近几年，频发的食品问题将食品安全推向风口浪尖，香肠作为中国传统的发酵食品，深受消费者喜爱，试验在制作香肠过程中，添加由清酒乳酸杆菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）制成的复合发酵剂，结果发现，添加复合发酵剂的香肠在pH和AW比自然发酵的香肠低3.75%和2.66%；减少香肠中有害物质组胺和亚硝酸盐含量，在发酵结束时，复合发酵香肠的组胺和亚硝酸盐含量分别是1.43和1.08 mg/kg，比自然发酵香肠低16.86%和30.77%；并且能增强香肠风味，延缓香肠氧化，复合发酵香肠的酸价是1.34 mg/kg，比自然发酵香肠的酸价低4.96%。

有研究学者通过在传统香肠中接种单一的发酵剂来提高香肠的食用安全性，但无法弥补因为提高安全性而带来的风味和感官上的缺失。试验采用复合发酵剂，能保证香肠品质且提高食用安全性，试验旨在改善香肠传统工艺，为广大消费者提供风味独特及安全的发酵食品。