山葡萄皮花色苷提取工艺优化及其组分分析

王鑫，韩茜宇*，薛宏坤

1. 大理大学公共卫生学院（大理 671003）；2. 黑龙江国际旅行卫生保健中心（哈尔滨 150090）；3. 清华大学工程物理系，粒子与辐射成像教育部重点实验室（北京 100084）

“双丰”山葡萄为葡萄科葡萄属植物，具有显著的抗寒、抗旱特点，被广泛种植于中国东北地区，其果实柔软多汁，风味独特，且含有丰富的天然活性成分，备受人们喜爱[1]。“双丰”山葡萄主要用于制作果汁和果酒，在产品制作过程中，葡萄皮通过作为副产物（占整个葡萄的10%）被大量遗弃，造成环境污染和资源浪费。葡萄皮中富含大量花色苷、多酚、维生素、超氧化物歧化酶等活性成分，可作为天然活性成分的重要来源。因此，如何将副产物变废为宝已成为科研关注热点。

花色苷是葡萄皮中重要的活性成分之一，其基本结构单元为C6—C3—C6骨架构成的2-苯基苯并吡喃[2]，结构如图1所示。因独特的结构使其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、预防心血管疾病和增强视力等功效[3]。如何高效地从“双丰”山葡萄皮中提取花色苷，从而提高山葡萄的附加值，已成为科研人员亟待解决的问题。花色苷提取主要采用传统的浸提法，该方法存在效率低、耗时长、萃取溶剂消耗量大、后期易造成热敏性物质的降解等问题[4]，无法满足对高效率和高得率花色苷的需求。超声辅助提取法作为一种新型的植物活性成分提取技术，利用超声波的空化效应、热效应、机械效应加速细胞壁破裂，减小目标成分的扩散阻力，使细胞内的目标成分更容易从细胞中扩散到周围溶剂，从而有效提高目标成分得率[5-6]。因此，该技术被广泛应用于黄酮[7]、多酚[8]、多糖[9]、油类[10]等的提取。而关于采用超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷的研究鲜见报道。

图1 花色苷的基本结构[2]

鉴于此，采用超声辅助提取技术对“双丰”山葡萄皮花色苷进行提取，探究超声功率、超声时间、提取温度、料液比对花色苷得率的影响，并通过正交试验优化其提取工艺；在此基础上，采用高效液相色谱-质谱联用技术对“双丰”山葡萄皮花色苷组分进行鉴定，以期提高“双丰”山葡萄的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“双丰”山葡萄（东北小兴安岭地区），成熟后于8月中旬采摘，除杂、清洗、晾干、去皮，果皮置于-20 ℃的冷冻干燥机冻至48 h，然后用植物粉碎机将其粉碎，过40目筛，制成“双丰”山葡萄皮粉末，密封避光保存在-18 ℃冰箱中备用。

甲酸、乙腈、甲醇、乙醇（均为色谱纯，美国Fisher公司）；矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品（纯度≥95%，美国诺威公司）；醋酸纤维素膜（0.45 mm，天津市科密欧化学实剂有限公司）；AB-8大孔树脂（日本三菱公司）。

1.2 仪器与设备

KQ600DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；220D电子分析天平（上海力辰仪器科技有限公司）；J-HH-6A精密数显恒温水浴锅（上海胜卫电子科技有限公司）；LAMBDA35型紫外分光光度计（美国Perkin Elmer公司）；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵（郑州紫拓仪器设备有限公司）；DRYER真空冷冻干燥器（德国西门子公司）；Agilent1260高效液相色谱-布鲁克质谱联用仪（美国Agilent公司）。

1.3 方法

1.3.1 超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷

准确称取2.000 0±0.000 5 g经1.1所制得的“双丰”山葡萄皮粉末置于真空包装袋中，按照不同料液比加入体积分数60%乙醇溶液[11]，使其充分混合，封口，将其放入超声设备中进行提取，同时固定不同提取温度，提取结束后，将萃取液置于离心机中以5 000 r/min离心15 min，收集上清液，然后将所得的残渣重复上述操作提取2次，合并3次所得滤液，随后用醋酸纤维素膜（0.45 mm）过滤，所得的滤液置于4 ℃冰箱避光保存备用。

1.3.2 超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷的单因素试验

称取2.000 0±0.000 5 g“双丰”山葡萄皮粉末样品作为提取对象，选择体积分数60%乙醇作为提取溶剂，考察不同超声功率、提取时间、提取温度和料液比对“双丰”山葡萄皮粉末中花色苷含量的影响。在预试验基础上，设定超声功率100，200，300，400和500 W 5个水平；超声时间20，25，30*，35和40 min 5个水平；提取温度30，40，50*，60和70 ℃ 5个水平；料液比1∶10，1∶20，1∶30*，1∶40和1∶50（g/mL），每组试验重复3次。（注：*表示当考察其他参数对“双丰”山葡萄皮粉末花色苷含量影响时，用*标记的因素保持恒定水平。）

依据单因素试验结果，设计L9(33)正交试验，正交试验因素及水平编码如表1所示。

表1 超声辅助提取山葡萄皮粉末花色苷的L9(33)正交试验因素及水平

1.3.3 花色苷含量的测定

采用pH示差法测定样品中花色苷含量，参考于泽源等[12]的方法并略做改动。取1 mL样品，分别加入9 mL pH 1.0氯化钾缓冲液和9 mL pH 4.5乙酸钠缓冲液，将其混合，避光静置1 h，分别在520和700 nm处测定其吸光度，花色苷的含量表达式如式（1）所示。

式中：c为样品中花色苷含量，mg/g；A为样品提取液的吸光度；DF为稀释倍数；Mw为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；Ma为矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；L为比色皿光程，cm；V为总体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.4 HPLC-ESI/MS法对“双丰”山葡萄皮粉末花色苷组分鉴定

样品准备：在最佳工艺条件下获得的“双丰”山葡萄花色苷提取液，将其在50 ℃旋转蒸发仪减压浓缩，准确移取20 mL山葡萄皮花色苷浓缩液，并将其注入已活化的AB-8大孔树脂柱（2.6 cm×60 cm）中充分吸附，进样流速1.5 mL/min，进样完全后，依次用酸化的去离子水（0.01% HCl）、30%乙醇溶液（0.01% HCl）和95%乙醇溶液（0.01% HCl）洗脱，洗脱流速1.0 mL/min，收集洗脱液，将其在50 ℃旋转蒸发仪减压浓缩，得到山葡萄皮花色苷纯化液，将其在冷冻干燥机中冻干成粉，将其用0.1% HCl-甲醇溶液稀释后，配制成浓度为0.1 mg/mL的样品溶液，溶液过0.45 μm滤膜，用于HPLC分析。

色谱条件：Aglient 1260 C18柱（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流动相A为体积分数5%甲酸水溶液，流动相B为乙腈-水-甲酸（体积比61.5∶37∶2.5）。洗脱程序：0～5 min，5%～20%流动相B，保持5 min；5～15 min，20%～25%流动相B，保持5 min；15～25 min，25%～30%流动相B，保持5 min；25～35 min，30%～5%流动相B，保持5 min；流速0.8 mL/min；柱温25 ℃；进样量25 μL；检测波长520 nm。

质谱条件：电喷雾电离离子源（ESI），质谱采用正离子扫描方式，质量扫描范围m/z200～2 000，毛细管电压4.5 kV，雾化器压力1.5 bar，干燥温度220 ℃。

1.3.5 数据处理

每组试验重复3次，结果用“平均值±标准差”表示；采用SPSS 16.0软件对每组试验数据进行方差分析（ANOVA）；采用SAS 8.0软件分析结果的显著差异；Origin 9.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素对“双丰”山葡萄皮花色苷含量的影响

超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷的单因素试验结果如图1所示。

由图2（A）可知，超声功率100～300 W时，随超声功率增加，花色苷得率呈显著增加趋势（p＜0.05），在300 W时，花色苷得率取得最大值（0.62±0.03 mg/g），其原因是随超声功率增加，机械震动效应和空化效应显著增加，使得在萃取液中产生较大剪切力，引起山葡萄皮细胞壁破裂，传质阻力降低，扩散系数增加，进而促进花色苷从山葡萄皮细胞中快速扩散出来[13]。随后继续增加超声功率，花色苷得率呈现显著降低趋势（p＜0.05）。这归因于在过高的超声功率下，高强度的空化效应破坏花色苷结构，同时也会引起非花色苷类杂质的溶解，导致花色苷溶解度降低[14]，从而使得花色苷得率呈现显著降低趋势。故选择超声波功率为200，300和400 W作为后续正交试验的因素水平。

由图2（B）可知，超声时间20～30 min时，花色苷得率随超声时间延长呈现显著增加趋势（p＜0.05），随后继续延长超声时间，花色苷得率无显著变化（p＞0.05）。其原因是在萃取初期，花色苷在细胞内外的浓度梯度较大，有利于花色苷从细胞中扩散到周围溶剂中，使得花色苷得率显著增加。进一步延长超声时间，可能由于萃取液中花色苷浓度与山葡萄皮细胞内花色苷浓度一致，内外浓度梯度趋近于零，即萃取液中花色苷达到饱和状态。因此，进一步延长超声时间，花色苷得率基本保持不变，故超声时间设定为30 min，后续不再优化超声时间。

由图2（C）可知，随提取温度增加，花色苷得率呈现先显著增加后显著降低趋势（p＜0.05），提取温度50 ℃时，花色苷得率取得最大值（0.68±0.01 mg/g）。其原因是随提取温度增加，萃取液黏度降低，扩散系数和溶解度增加，使得花色苷更容易从细胞中被扩散出来[15]，故花色苷得率增加。继续增加提取温度不利于花色苷提取，这是由于花色苷属于热敏性成分，高温破坏花色苷与糖分子形成的糖苷键，引起花色苷呈指数形式降解[16]，从而使花色苷得率降低，故提取温度选择40，50和60 ℃作为后续正交试验的因素水平。

由图2（D）可知，料液比1∶10～1∶30（g/mL）时，花色苷得率随料液比增加呈现显著增加趋势（p＜0.05），其原因是随萃取溶剂增加，细胞内外花色苷浓度梯度增加，浓度梯度作为花色苷传质驱动力，较大的浓度梯度驱动有利于花色苷由内向外扩散，从而增加花色苷得率。料液比超过1∶30（g/mL）时，继续增加料液比，花色苷得率则呈现显著降低趋势（p＜0.05）。归因于过多溶剂会产生杂质、色素等，降低花色苷的溶解度，从而不利于花色苷的提取[17]；另外溶剂过大，会对后续提取物的浓缩带来很大的工作量。因此，综合考虑，料液比选择1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）作为后续正交试验的因素水平。

图2 超声功率（A）、超声时间（B）、提取温度（C）和料液比（D）对山葡萄皮花色苷含量的影响

2.2 超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷的正交试验结果

超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷的正交试验设计及结果如表2所示。通过极差大小确定各因素对花色苷得率影响的主次顺序：C＞A＞B。最优水平组合为A2B3C3，即超声功率300 W、提取温度60 ℃、料液比1∶40（g/mL）。对最优试验条件进行3组平行试验验证，在最优参数组合下山葡萄皮花色苷得率为0.71±0.03 mg/g，说明超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷工艺得到优化。

表2 超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷的L9(33)正交试验设计及结果

2.3 “双丰”山葡萄皮花色苷组分鉴定

在最佳参数组合下所得花色苷粗提液，经AB-8大孔树脂纯化后所得样品，再经HPLC-ESI/MS分析，其结果如图3、图4和表3所示。

由图3可知，山葡萄皮粗提液经AB-8大孔树脂纯化后得到3种花色苷组分，结合各组分的色谱保留时间、分子离子峰和丢失的碎片来共同判断3种花色苷组分的组成。图3中1号峰的质谱图如图4（A）所示，分子离子[M+]为465.0，碎片离子m/z303.1，其中m/z303是飞燕草素的特征离子，丢失的碎片m/z162，可能为葡萄糖和半乳糖，结合资料分析[18]，最终可判定1号峰为飞燕草素-3-葡萄糖苷。图3中2号峰的质谱图如图4（B）所示，分子离子[M+]为449.0，碎片离子m/z287.1，m/z287是矢车菊素的特征离子，丢失的碎片162，研究结果与Pertuzatti等[19]研究高丛蓝莓花色苷中的矢车菊素-3-葡萄糖苷的质谱信息相一致。因此，2号峰为矢车菊素-3-葡萄糖苷。图3中3号峰的质谱图如图4（C）所示，分子离子[M+]为625.2，碎片离子m/z463.1和m/z301.2，可能是由分子离子失去一分子己糖苷（Δm/z162）而成，m/z463.1和301.3之间也相差一个分子量162的己糖苷，且m/z301是芍药素色素的特征离子，推测3号峰物质可能是带有两个己糖苷的芍药色素花色苷。该研究结果与Wang等[20]在相同高效液相色谱-质谱检测条件下鉴定出芍药素-3, 5-二己糖苷的质谱信息一致。因此，最终判定3号峰为芍药素-3, 5-二己糖苷。

图3 经AB-8大孔树脂纯化后所得山葡萄皮花色苷组分的液相色谱图

图4 花色苷组分质谱图

表3 山葡萄皮花色苷种类鉴定表

3 结论

在单因素试验基础上，通过正交试验优化出超声辅助提取“双丰”山葡萄皮花色苷的工艺：超声功率300 W、超声时间30 min、提取温度60 ℃、料液比1∶40（g/mL）。在此条件下花色苷得率为0.71±0.03 mg/g，经HPLC-ESI/MS鉴定发现山葡萄皮中包含3种花色苷组分。试验结果有助于提高“双丰”山葡萄的附加值，同时可为天然花色苷保健品的开发提供物质基础。