超声波酶法辅助提取人参皂苷工艺优化

李飞，穆娜，曲玉涵，冉旭东，王依，唐文翔

吉林化工学院生物与食品工程学院（吉林 132022）

人参（Panax ginsengC.A Mey）为五加科多年宿生草本植物，是传统的名贵中药材，在亚洲已有上千年的药用历史，其中的最为重要的有效成分为人参总皂苷，具有抗肿瘤、调节血糖、抗炎、抗氧化等作用，对人体神经系统、心血管系统、内分泌系统、免疫系统等具有广泛的生物活性，并已经广泛应用于临床实践[1-4]。2012年卫生部批准5年以下人参（人工种植）为新资源食品，可以作为产品原料添加到普通食品当中，这是对人参应于食品中给予科学的支持与肯定[5]。

传统的人参皂苷提取方法有回流法，煎煮法、浸渍法等[6]。近年来，新的提取方法不断的应用于人参皂苷提取的研究中。试验使用超声辅助酶法提取人参皂苷的工艺进行研究，在单因素试验的基础上，采用响应面分析对超声辅助酶法提取工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

人参（市售，吉林省集安地区人工种植5年参）；人参皂苷标准品（成都曼斯特生物有限公司）；无水乙醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸、正丁醇均为分析纯；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；超声仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；紫外分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 人参皂苷提取工艺流程

人参→干燥→粉碎→过80目筛→准确称取4.0 g人参粉末→添加一定比例缓冲液中→酶解→灭酶（80℃，10 min）→超声处理→离心（4 000 r/min，10 min）→得上清液→取5 mL使用水饱和正丁醇3次萃取→减压蒸干→甲醇溶解

1.2.2 人参皂苷含量测定

标准曲线绘制：准确量取人参皂苷Re对照品溶液0，10，20，30，40和60 mg，将它们分别放入10 mL的具塞试管中，60 ℃的恒温水浴锅中蒸干，置于冰水中；分别加入0.5 mL 8%的香草醛-乙醇溶液和5 mL 72%的浓硫酸，旋涡混合器充分混合均匀，60 ℃水浴锅中反应10 min后，冰水浴10 min；于544 nm下测定其吸光度，人参总皂苷含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定：取1.2.1中用甲醇溶解后的溶液25 μL于试管中，水浴蒸干，加入8%的香草醛溶液0.5 mL 72%的硫酸溶液5 mL，旋涡混合器使其充分混匀后，置于60 ℃的恒温水浴中反应10 min，立即取出，置于冰水混合物中，冷却10 min，544 nm下测定吸光度。

1.2.3 单因素试验

分别以纤维素酶添加量（0.05%，0.10%，0.15%，0.20%和0.25%）、果胶酶添加量（0.10%，0.15%，0.2%，0.25%，0.30%和0.35%）、料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL））、酶解温度（30，35，40，45和50 ℃）、酶解时间（30，60，90，120和150 min）、酶解pH（4，5，6，7和8）、超声时间（5，10，15，20，25，30，35和40 min）、超声功率（200，300，400，500，600和700 W）为影响因素，研究不同水平下各因素对人参总皂苷提取率的影响。

1.2.4 Box-Behnken试验设计

以单因素试验得到的结果为基础，以料液比、酶解时间以及超声时间为响应因子，进行三因素三水平的Box-Behnken试验。依据回归分析确定各工艺条件的影响因素，以人参皂苷含量为响应值，分析优化的最佳提取条件。试验的各因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平表

1.2.5 数据分析

所有试验均重复3次，数据均以平均值±SD表示，利用SPSS 17.0方差分析对组间和组内差异进行比较，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

按照1.2.2中所述方法，以人参皂苷Re含量作为总人参皂苷含量的参考，绘制标准曲线得图1。

图1 人参皂苷标准曲线

2.2 单因素试验结果

分别测定在不同纤维素酶添加量、果胶酶添加量、料液比、酶解温度、酶解时间、酶解pH超声时间、超声功率条件下，各单因素对人参总皂苷的影响，绘制图2。

人参皂苷的含量在纤维素酶添加量为0.20%之前随着酶添加量的增加，提取率也在随之逐渐增加，在添加酶量为0.20%时达到峰值，即为纤维素酶的最适添加量。人参皂苷的含量在果胶酶添加量为0.05%～0.25%之间逐渐增加，在添加酶量为0.25%时达到峰值，从曲线的结果来看，在果胶酶添加量为0.20%和0.25%时差别不是很大，因此选取与纤维素酶相同的添加量，即果胶酶添加量也为0.20%。随着料液比的增加，皂苷提取率逐渐减小，由于缓冲液体积的增大，稀释了人参粉末溶液的浓度，选取的料液比为1∶20（g/mL）。人参皂苷的最大提取量在酶解温度为45 ℃时得到，随着温度的再次升高，皂苷得率在减小，因此选用45 ℃最为适宜。酶解时间在30～60 min之间的人参皂苷含量呈递减趋势，随着酶解时间的增加酶解能力逐渐加强，在酶解时间为60 min时，人参总皂苷的含量显示出峰值，说明在此时间下人参总皂苷的提取率较大，含量较多，因此应选择60 min作为其最优酶解时间。在酶解pH 4～5的范围内人参总皂苷的含量逐渐增加，到pH为5时达到峰值，应选择pH为5作为其最优酶解pH。超声时间为5～30 min时含量逐渐增大，但是在超声时间超过30 min又之后逐渐下降，因此选择30 min作为超声时间最宜。人参皂苷含量在超声功率为200～500 W时逐渐增大，在功率为500 W时皂苷提取量达到峰值，之后功率增大皂苷含量逐渐降低，为得到最大皂苷得率，选择500 W作为最优超声功率。

图2 超声辅助酶法提取单因素试验结果

2.3 响应面优化试验结果

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，在单因素试验结果的基础上，选取料液比、酶解时间、超声时间3个因素，采用三因素三水平响应面分析法进行试验设计，结果见表2。将所得的试验数据采用Design Expert 8.0.6软件进行多元回归拟合，得到以人参总皂苷含量为目标函数的二次回归方程：

Y=-1.559 2×10-4A2-5.045 56×10-6B2+9.188×10-5C2+2.5×10-6AB+4.76×10-6AC+3.946 67×10-6BC+7.047 6×10-3A+3.976 83×10-4B-6.204 3×10-3C+ 0.045 888

表2 设计方案与结果

由表3可以看出，模型的决定系数R2=0.943 2，修订系数R2adj=0.870 2，变异系数CV=4.43%，这些数值都说明，此多项式模型的有效性和准确性都是合乎常理、合乎要求的。

表3 回归方程各项的方差分析

通过响应面软件分析可知，料液比为1∶23.42（g/mL），酶解时间为54.98 min，考虑到实际操作的便利，将最佳提取工艺条件进行修正，料液比为1∶23.4（g/mL），酶解时间为55 min，超声时间为25 min时人参皂苷的含量有最大值，人参皂苷含量为0.045 8（g/g），提取率为4.58%。

2.4 验证试验结果

为验证响应面模型分析的正确性，按照给出的最佳提取条件进行试验提取人参总皂苷，同时为避免试验误差，试验平行3次进行。得到的人参总皂苷含量平均含量为0.046 3（g/g），提取率为4.63%实际值与预测值差异不显著。所以可以认得到的工艺优化条件基本准确可靠，可以对人参皂苷提取进行很好的模拟和预测。

3 结论与讨论

研究在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，通过响应面分析法对超声辅助酶法提取人参总皂苷工艺进行优化，并得到回归方程。经回归分析并结合实际操作便利性，确定人参总皂苷提取的最佳工艺条件为纤维素酶、果胶酶添加量为0.20%，料液比为1∶23.4（g/mL），酶解温度为45 ℃，酶解时间为55 min，酶解pH为5，超声时间为25 min，超声功率为500 W，人参皂苷的提取率为4.63%，实际值与预测值差异不显著，试验结果良好，说明该模型可靠性较高，能很好地预测各因素与人参皂苷提取率之间的关系。方法与使用索氏提取提取率3.27%[8]相比，具有条件温和、操作方便及提取率高等特点，超声辅助酶法辅助提取人参皂苷的工艺建立，为人参资源的开发与利用提供了试验依据，将对其发展起到积极促进作用。