黑柴胡乙酸乙酯部位中的柴胡皂苷元和黄酮类化学成分

李 娟， 洪 洲， 郑 萍，3， 王秀娟， 姚 遥

（1.宁夏医科大学药学院，银川 750004； 2.回医药现代化教育部重点实验室，银川 750004； 3.宁夏回药现代化工程技术研究中心，银川 750004； 4.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004）

柴胡是我国传统常用中药，临床用途广泛。除中国药典规定的北柴胡和狭叶柴胡之外，尚有多种柴胡属植物也供药用，其中黑柴胡（Bupleurum smithiiWolff）在中国北方地区分布广泛，资源丰富，在西北地区常做为柴胡的代用品使用[1]。目前对黑柴胡化学成分和药理活性的研究报道很少，如有研究者从黑柴胡中分离得到了多种皂苷类化学成分[2-3]，还有对北柴胡和黑柴胡的解热、抗炎作用进行比较的报道[4]。为进一步促进黑柴胡资源的开发利用，探讨其作为柴胡代用品的合理性，本文运用多种色谱手段对黑柴胡中的化学成分进行了研究。从黑柴胡75%乙醇提取物乙酸乙酯萃取层中分离鉴定了10 个化合物，分别为柴胡皂苷元A（1），柴胡皂苷元C（2），柴胡皂苷元D（3），柴胡皂苷元E（4），柴胡皂苷元F（5），柴胡皂苷元Q（6），3，5，7-三羟基-3’，4’-二甲氧基黄酮（7），山奈酚（8），槲皮素（9），异鼠李素（10）。其中化合物2~7 为首次从该植物中分离得到，现分析如下。

1 材料

1.1 药材与试剂

黑柴胡药材产地为内蒙古，经宁夏药检所韩文欣主任药师鉴定为黑柴胡（B. smithii）的干燥根。标本保存于宁夏医科大学基础医学院医用化学系实验室（标本编号YH20160301）。

常规有机试剂均为分析纯，由天津大茂化学试剂厂生产；GF254 薄层色谱硅胶和柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂产品；Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶由美国Pharmacia 公司生产；高效液相所用色谱甲醇为美国Fisher 公司生产。

1.2 仪器

中药粉碎机为天津市泰斯特仪器有限公司产品；RE-2000 型旋转蒸发仪由上海亚荣生化仪器厂生产；多功能中药提取浓缩机由上海达程设备有限公司生产；D-2000 型高效液相色谱仪为日本日立公司产品；AVANCE-400 型核磁共振波谱仪由瑞士Bruker 公司生产；XT-4 数字显微熔点测定仪（温度未校正）为上海精科分析仪器有限公司产品；TSQ 三重四级杆质谱仪由美国Thermo Scientific 公司生产。

2 方法

2.1 药材的提取

取黑柴胡药材5 kg 粉碎成粗粉，置于多功能中药提取浓缩机中，使用75%乙醇作为提取溶剂，料液比为1∶8，温度设置为75 ℃，回流提取3次，每次提取时间为2 h。提取液减压浓缩后烘干，得到黑柴胡提取物浸膏906.92 g。将浸膏在水中混悬，使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，各萃取3~5 次直至萃取充分，萃取液减压浓缩后烘干，得到乙酸乙酯萃取部位质量为109.35 g。

2.2 化合物的分离纯化

乙酸乙酯萃取部位用硅胶柱色谱分离，使用二氯甲烷-甲醇系统（100∶0-0∶100）进行梯度洗脱，根据TLC 结果合并色谱特征类似的组分，共得到12 个组分，标记为Fr.A～Fr.L。Fr.B 继续使用硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇系统（100∶2-100∶5）梯度洗脱，点样合并后得到组分Fr.B1～Fr.B4。其中Fr.B4 经重结晶得到化合物1，Fr.B1 经重结晶得到化合物2。Fr.G 使用二氯甲烷-甲醇系统（100∶9-100∶20）在硅胶柱上分离，点样合并后得到组分Fr.G1～Fr.G4。Fr.G1 组分利用葡聚糖凝胶柱进一步分离，使用二氯甲烷-甲醇（40∶60）洗脱，收集流分后重结晶得化合物3；Fr.G3 利用葡聚糖凝胶柱进一步分离，使用二氯甲烷-甲醇（40∶60）洗脱，收集流分后重结晶得化合物9。Fr.D 继续使用硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇系统（100∶3-100∶5），收集流分点样合并后得到组分Fr.D1～Fr.D4。Fr.D1 和Fr.D3 组分利用葡聚糖凝胶柱进一步分离，使用二氯甲烷-甲醇（40∶60）洗脱，收集流分后重结晶分别得到化合物4 和化合物5。Fr.I 使用石油醚-丙酮系统（100∶12-100∶20）在硅胶柱上分离，收集流分点样合并后得到组分Fr.I1～Fr.I4。其中Fr.I3 利用葡聚糖凝胶柱进一步分离，使用二氯甲烷-甲醇（40∶60）洗脱，收集流分合并后利用制备型HPLC 进行纯化，流动相为乙腈-水（70∶30），得到化合物6 和化合物8。Fr.F使用二氯甲烷-甲醇系统（100∶5-100∶7）在硅胶柱上分离，点样合并后得到组分Fr.F1～Fr.F3，其中Fr.F3 重结晶得到化合物7。组分Fr.H 使用石油醚-丙酮系统（100∶5-100∶20）在硅胶柱上分离，收集流分点样合并后得到组分Fr.H1～Fr.H5，Fr.H2重结晶得化合物10。

3 结构鉴定

化合物1 白色固体（甲醇），在GF254 硅胶板上展开后未见暗斑或荧光，喷10%硫酸乙醇溶液加热后可观察到紫红色斑点。该化合物1H-NMR（400 MHz，C5D5N）谱最显著的特征是6个甲基单峰氢信号δ：0.86，0.91，0.96，1.00，1.04，1.56（6×CH3）和1 组碳碳双键上的氢信号δ 5.58（1H，d，J=10.8 Hz，H-11），6.59（1H，d，J=10.8 Hz，H-12）。13C-NMR（100 MHz，C5D5N）谱中给出了30 个碳信号（见表1），结合薄层特征和氢谱数据判断其可能为三萜类化合物。其中δ 76.4（C-16）为与氧相连的次甲基碳信号，表明其16 位β-构型羟基的存在。经与文献数据对比发现，其核磁波谱数据特征与柴胡皂苷b1 非常类似，但缺少了糖的波谱信号部分，因此推断其为柴胡皂苷元A，即柴胡皂苷b1 的苷元。经与文献[5]对照波谱数据基本一致，鉴定该化合物为柴胡皂苷元A。

化合物2 白色固体（甲醇），在GF254 硅胶板上展开后未见暗斑或荧光，喷10%硫酸乙醇溶液加热后可观察到紫红色斑点。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）谱最显著的特征是7 个甲基的单峰氢信号δ：0.88，0.91，0.97，1.01，1.06，1.34，1.45（7×CH3）和1 组碳碳双键上的氢信号δ 5.55（1H，d，J=10.4 Hz，H-11），6.54（1H，d，J=10.4 Hz，H-12）；13C-NMR（100 MHz，C5D5N）谱中给出了30 个碳信号（见表1），结合薄层特征和氢谱数据判断其可能为三萜类化合物，δ 76.3（C-16）给出了一个连氧的次甲基碳信号，表明其16 位β-构型羟基的存在。经对比发现其核磁共振波谱数据特征与化合物1 较为相似，但与之相比少了一个连氧的亚甲基波谱信号，同时多了一个甲基的信号。与文献中的核磁数据对比发现，该化合物的C-23位上没有羟基，其波谱数据与文献[5]对照基本一致，因此鉴定该化合物为柴胡皂苷元C。

化合物3 白色固体（甲醇），在GF254 硅胶板上展开后未见暗斑或荧光，喷10%硫酸乙醇溶液加热后可观察到紫红色斑点。该化合物的1HNMR（400 MHz，C5D5N）谱给出了6 组甲基的单峰氢信号δ:0.87，0.89，0.96，1.00，1.04，1.55（6×CH3），1 组碳碳双键上的耦合氢信号δ 5.52（1H，d，J=10.4 Hz，H-11）和6.51（1H，d，J=10.4 Hz，H-12）。13C-NMR（100 MHz，C5D5N）谱中给出了30 个碳信号（见表1），结合薄层特征和氢谱数据判断其可能为三萜类化合物，在δ 67.5（C-16）给出了一个连氧的次甲基碳信号，表明其16 位α-构型羟基的存在。经与文献中的核磁数据对比发现，其波谱数据特征与柴胡皂苷b2 非常类似，但缺少了糖的波谱信号部分，因此推断其为柴胡皂苷元D，即柴胡皂苷b2 的苷元，其波谱数据与文献[5]对照基本一致。

化合物4 白色固体（甲醇），在GF254 硅胶板上展开后未见暗斑或荧光，喷10%硫酸乙醇溶液加热后可观察到紫红色斑点。该化合物的1HNMR（400 MHz，C5D5N）谱给出了7 个甲基的单峰氢信号δ: 0.87，0.90，0.97，0.99，1.05，1.33，1.45（7×CH3），1 组碳碳双键上的氢信号δ 5.55（1H，d，J=10.8 Hz，H-11）和6.54（1H，d，J=10.8 Hz，H-12）；13C-NMR（100 MHz，C5D5N）谱中给出了30 个碳信号（见表1），结合薄层特征和氢谱数据判断其可能为三萜类化合物。经与文献中的核磁数据对比发现，其波谱数据特征与柴胡皂苷c 非常类似，但缺少了糖的波谱信号部分，因此推断其为柴胡皂苷元D，即柴胡皂苷c 的苷元，其波谱数据与文献[6]对照基本一致。

表1 化合物1-6 的碳谱数据（100 MHz，C5D5N）

化合物5 白色粉末（甲醇），薄层展开后喷硫酸-乙醇溶液加热呈紫红色斑点。ESI-MS m/z:495.2［M+Na］+，507.2［M+Cl］－，由质谱数据推测其分子量为472。化合物的1H-NMR（400 MHz，C5D5N）谱中，δ 5.59（1H，dd，J =8.4 Hz，2.4Hz）和5.97（1H，d，J= 8.4 Hz）是一对相互耦合的碳碳双键氢信号，且为顺式构型；在高场区有6 个甲基 的 单 峰 氢 信 号δ 1.43，1.05，1.02，1.00，0.90，0.86（6×CH3）。13C-NMR（100 MHz，C5D5N）谱中给出了30 个碳信号（见表1），结合薄层特征和核磁波谱数据判断其可能为环氧醚型柴胡皂苷元类化合物。其波谱数据与参考文献[6]对照基本一致，因此鉴定该化合物为柴胡皂苷元F。

化合物6 白色固体（甲醇），在GF254 硅胶板上展开后未见暗斑或荧光，喷10%硫酸乙醇溶液加热后可观察到紫红色斑点。该化合物的1HNMR（400 MHz，C5D5N）谱给出了5 个甲基的单峰氢信号δ:0.87，0.96，1.02，1.05，1.10（5×CH3），1组碳碳双键上的氢信号δ 5.58（1H，d，J=10.8 Hz，H-11）和6.62（1H，d，J=10.8 Hz，H-12），13C-NMR（100 MHz，C5D5N）谱中给出了30 个碳信号（见表1），结合薄层特征和氢谱数据判断其可能为三萜类化合物，在δ 76.3（C-16）给出了一个连氧的次甲基碳信号，表明其结构中16 位β-构型羟基的存在。经对比发现其核磁共振波谱数据特征与化合物1 较为相似，但与之相比多了一个连氧的亚甲基波谱信号，同时少了一个甲基的信号。与文献中的核磁数据对比发现，该化合物的C-30 与羟基相连，与文献[7]对照波谱数据基本一致，由此鉴定该化合物为柴胡皂苷元Q。

化合物7 黄色固体（甲醇），在GF254 硅胶板上展开后可见黄色斑点，紫外灯下检视可见暗斑，能与三氯化铝反应，由薄层特征和核磁数据推测其可能为黄酮类化合物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ:12.36（1H，s，5-OH），10.69（1H，s，7-OH），9.68（1H，s，3-OH），7.72（1H，dd，J=10.4，2.0 Hz，H-6′），7.66（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），6.92（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.50（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.17（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），3.15（6H，s，-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ: 146.3（C-2），135.1（C-3），175.5（C-4），155.8（C-5），98.0（C-6），163.3（C-7），93.2（C-8），160.2（C-9），102.9（C-10），121.4（C-1′），114.9（C-2′），146.2（C-3′），146.9（C-4′），111.3（C-5′），122.1（C-6′），58.0（-OCH3），56.1（-OCH3）。波谱数据与文献[8]对照基本一致，确定该化合物为3，5，7-三羟基-3’，4’-二甲氧基黄酮。

化合物8 黄色结晶（甲醇），在GF254 硅胶板上展开后可见黄色斑点，紫外灯下检视可见暗斑，能与三氯化铝反应，由薄层特征和核磁数据推测其可能为黄酮类化合物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ: 6.20（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.42（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.88（2H，d，J=7.6 Hz，H-3，H-5′），7.96（1H，d，J=7.6 Hz，H-2′，H-6′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ: 147.1（C-2），135.4（C-3），176.2（C-4），160.1（C-5），97.9（C-6），163.8（C-7），93.5（C-8），156.2（C-9），103.2（C-10），121.5（C-1′），129.4（C-2′），115.3（C-3′），159.1（C-4′），115.5（C-5′），129.4（C-6′）。其核磁数据与文献[9]对照基本一致，结合理化性质和波谱数据鉴定该化合物为山奈酚。

化合物9 黄色固体（甲醇），m.p.312~314 ℃，ESI-MSm/z303［M+H］+，在GF254 硅胶板上展开后可见黄色斑点，紫外灯下检视可见暗斑，能与三氯化铝反应，由薄层特征和核磁数据推测其可能为黄酮类化合物。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 6.15（1H，s，H-6），6.35（1H，s，H-8），7.70（1H，d，J=1.6 Hz，H-2′），6.86（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），7.59（1H，dd，J=8.4，1.6 Hz，H-6′）；13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ: 148.5（C-2），137.1（C-3），177.0（C-4），162.3（C-5），99.1（C-6），165.6（C-7），94.2（C-8），158.1（C-9），104.3（C-10），123.9（C-1′），115.5（C-2′），146.0（C-3′），147.6（C-4′），116.0（C-5′），121.5（C-6′）。结合理化性质和波谱数据鉴定该化合物为槲皮素，其核磁数据与文献[10]对照基本一致。

化合物10 黄色粉末（甲醇），在GF254 硅胶板上展开后可见黄色斑点，紫外灯下检视可见暗斑，能与三氯化铝反应，推测其可能为黄酮类化合物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ: 6.15（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.43（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），7.73（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），6.89（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），7.67（1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ:147.1（C-2），136.3（C-3），176.2（C-4），160.4（C-5），98.1（C-6），164.2（C-7），93.2（C-8），156.0（C-9），103.1（C-10），121.9（C-l′），116.3（C-2′），149.4（C-3′），147.1（C-4′），112.0（C-5′），121.3（C-6′）。数据与文献[11]对照基本一致，鉴定该化合物为异鼠李素。