同型半胱氨酸对A7r5细胞凋亡及相关凋亡因子Bcl-2和Bax表达的影响

王小婕，李学善，黄燕飞，张 燕，兰小梅

动脉粥样硬化(AS)是冠心病的基础病变，随着社会的发展和人们生活水平的不断提高，由其导致的并发症和死亡率迅速增加。AS的发生与发展越来越受到人们的重视。Hcy 被认为是冠心病的独立危险因素，并和冠状动脉粥样硬化的严重程度关系密切[1-2],其可通过氧化应激、免疫和炎症反应等作用[3],使多种细胞(单核细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等)发生复杂的生物学变化,最终导致AS的发生。血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡在AS的发生发展中起到一定的作用，Hcy可诱导VSMCs凋亡。本文通过观察Hcy诱导A7r5细胞凋亡及研究线粒体凋亡途径的相关因子,探讨Hcy诱导VSMCs凋亡的分子机制，从而进一步探索Hcy在 VSMCs致AS过程中的分子机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：A7r5细胞由宁夏医科大学科技中心保存；同型半胱氨酸(Sigma公司)；胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养液、PBS缓冲液(美国Hyclone公司)；0.25% 胰蛋白酶(杭州吉诺生物医药技术有限公司)；AnnexinⅤ-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒，凯基全蛋白提取试剂盒，Braford蛋白含量检测试剂盒 (南京凯基生物科技发展有限公司)；ECL化学发光检测试剂盒(Bestbio)；兔抗Bcl-2、Bax多克隆抗体以及辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG (北京博奥森生物技术有限公司)；其他试剂采用国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：复苏冻存的A7r5细胞，用含有10% (体积分数)FBS、100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素的DMEM高糖培养液在37 ℃、含5% (体积分数)CO2、湿度恒定的培养箱中传代培养，3～5 d传代一次，实验用复苏后第3～5代对数生长期的细胞。

1.2.2 AnnexinⅤ-PE/7-AAD 流式细胞仪检测细胞凋亡率：采用不同浓度(0、200、500、1 000 μmol/L)的Hcy培养液对A7r5细胞分组培养24 h,每种浓度培养3份。用终浓度(1 000 μmol/L)的Hcy培养液分别孵育A7r5细胞 0、12、24、48 h,每个时间段培养3份。每组A7r5细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤，离心收集5×105细胞；在50 μl Binding Buffer 中加入5 μl 7-AAD染液，混匀后加入所收集细胞，混匀，室温避光反应15 min；反应后再加入450 μl Binding Buffer混匀，加入1 μl AnnexinⅤ-PE混匀，室温避光反应15 min。在1 h 内上流式细胞仪检测，CytoSoft 5.3软件分析凋亡率。

1.2.3 Western blot检测Bcl-2及Bax蛋白含量：将未用Hcy干预组(对照组)及用终浓度为1 000 μmol/L Hcy干预组(实验组)细胞分别培养24 h后，收集细胞；采用凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白，Braford蛋白含量检测试剂盒测定蛋白浓度，每组上样量均为30 μg，用5%的SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳。电泳完毕将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)转移膜上(Bio-Rad)。转膜后在含5%脱脂奶粉的TBS-T中封闭4 h,分别用抗Bcl-2和Bax抗体孵育，4 ℃过夜。膜清洗4遍后,同结合辣根过氧化物酶HRP的二抗室温摇床孵育4 h。用ECL化学发光检测试剂盒检测结果。用Quantity One-4.3.1软件测定灰度值，实验重复3次。

2 结果

2.1 培养的A7r5细胞：复苏细胞，经传代2次，培养48 h,于倒置显微镜下观察，A7r5细胞呈成纤维细胞样,形态规则，贴壁生长，长势良好。

2.2 不同浓度的Hcy对A7r5凋亡的影响：经流式细胞仪检测，不同浓度(0、200、500、1 000 μmol/L)Hcy干预A7r5细胞24 h的细胞凋亡率分别为(1.69±0.19)%、(5.72±1.29)%、(9.42±2.51)%、(17.34±2.86)%，细胞凋亡率随浓度增高递增,各组之间差异有统计学意义(F=107.743，P<0.05)。

2.3 不同时间同一浓度的Hcy对A7r5凋亡的影响：A7r5细胞在Hcy终浓度为1 000 μmol/L的培养液中分别培养0、12、24、48 h后,不同时间的Hcy干预的细胞凋亡率分别为(1.78±0.33)%、(8.27±1.45)%、(17.34±2.86)%、(23.72±3.21)%，细胞凋亡率随时间的延长递增,各组之间比较差异有统计学意义(F=226.8,P<0.05)。A7r5细胞在Hcy终浓度为1 000 μmol/L的培养液中分别培养0 h(对照组)及48 h(实验组)后，流式细胞仪检测细胞凋亡率的散点图结果见图1(目录后)。

2.4 Hcy对A7r5细胞凋亡相关因子的影响:将未用Hcy干预组(对照组)及用终浓度为1 000 μmol/L Hcy干预组(实验组)细胞分别培养24 h后，实验组Bcl-2蛋白的特异性条带明显弱于对照组，2组之间差异有统计学意义(t=4.221,P<0.05)，而其Bax蛋白的特异性条带明显强于对照组，2组之间差异有统计学意义(t=-6.966,P<0.05)。结果提示，实验组Bax蛋白表达被促进而Bcl-2蛋白表达被抑制，见图2(目录后)。

3 讨论

VSMCs是AS斑块主要的细胞成分，在AS发生发展的过程中起着重要作用。生理条件下VSMCs存在着增殖与凋亡的动态平衡，同时AS斑块的发生发展取决于此平衡。有研究证实,Hcy 水平增高是低密度胆固醇及总胆固醇水平升高、高密度胆固醇水平降低的独立危险因素[4]，血浆 Hcy 水平升高导致的高同型半胱氨酸血症与血栓、血管再狭窄、心肌梗塞，尤其是动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发病密切相关[5]。研究发现,AS患者血浆Hcy水平明显高于正常值,而且Hcy升高水平与AS程度及斑块的稳定性呈正相关性[6]。较早的研究发现，VSMCs凋亡和Hcy的作用呈时间和浓度依赖性[7]。邢跃等研究表明在1 000 μmol/L浓度范围内Hcy呈剂量依赖性同时在24 h 内Hcy呈时间依赖性诱导人VSMC凋亡[8]。本研究用Hcy干预体外培养的A7r5细胞，测定细胞凋亡率，结果与既往研究相符，进一步证实了Hcy可以诱导VSMCs凋亡，且呈时间与浓度依赖性。

细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程。机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径,其中线粒体途径是最重要的途径之一，Bcl-2家族蛋白是该途径的关键调节因素。实验表明，Bcl-2家族成员通过调节线粒体外膜的通透性和完整性起重要调控作用[9]。Bcl-2家族成员按其功能可分为抗凋亡的Bcl-2亚族(包括Bcl-2，Bcl-xL和Bcl-1等)和促凋亡的Bax家族(包括Bax，Bak，Bid和Bad等)，其中Bcl-2和Bax是最为重要的两个因子。Bcl-2家族成员之间易于形成同源或异源二聚体,这种二聚体反映调节细胞死亡和存活信号的平衡状态,是决定细胞存亡的关键。Bcl-2可与Bax形成异二聚体而阻断后者的促凋亡活性。大量研究显示，持续的高浓度Hcy水平会直接导致细胞发生不可逆的损伤效应，导致细胞坏死和凋亡的发生[10-11]。VSMCs凋亡与线粒体凋亡途径密切相关，随浓度增加Hcy可诱导Bax表达增加而促进VSMCs凋亡[12]。本研究显示，A7r5细胞经Hcy干预后，Bax蛋白表达增高的同时Bcl-2蛋白表达降低，提示Hcy可能通过激活线粒体途径诱导A7r5细胞凋亡。

Hcy可以通过促进VSMC凋亡促进AS性疾病的发生和发展，高Hcy血症的治疗策略已经成为一个重要的研究领域,阐明Hcy促进VSMC凋亡的分子机制将为制定干预策略提供新靶点和新思路。