独山瓜馥木总生物碱抗结核活性初探

周 蕾，安婷婷，赵秀芹，徐冬蕾，蒋 毅，王瑞白，万康林，杨再昌

结核病是由结核分枝杆菌感染导致的传染性疾病，是全球十大致死病因之一。耐药结核病的增多更加重了疾病负担[1]。2019年WHO全球结核病报告显示全球大约有1 000万结核病患者，死亡145万，利福平耐药结核病(Rifampin-resistant TB，RR-TB)患者人数约为48.4万，其中耐多药结核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)患者占78%，我国在全球30个结核病高负担国家中RR-TB患者数位于世界第三[2-3]。非结分枝杆菌(Non-tuberculous mycobacteria，NTM)是除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外的分枝杆菌的总称。由其引发的疾病逐年增加，尤其是非结和结核分枝杆菌的混合感染在耐药结核病中占到了30%以上，加重了结核的疫情和管理难度。

独山瓜馥木主要分布于贵州独山、安龙等地的山林中，是黔南地区的民族药材，在民间用药广泛，常用根部来活血除湿，治疗风湿和痨伤。本课题组的前期研究显示从独山瓜馥木提取的没食子酸成分具有抗结核活性，并与异烟肼具有协同作用，可部分降低异烟肼的耐药率[4]。提取的β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯，可以促进休眠型结核分枝杆菌复苏，和异烟肼联用可以杀死休眠型结核分枝杆菌[5]。为确定从独山瓜馥木中提取的总生物碱成分的抗结核活性及作为抗结核候选药物进一步研发的意义，本实验选取各耐药类型的结核分枝杆菌及临床常见非结核分枝杆菌对其抗分枝杆菌活性进行了全面的检测和评价。

1 材料与方法

1.1实验用菌株 实验菌株来源于中国疾病预防控制中心传染病所结核病室菌株库。23个菌株中包括19株结核分枝杆菌和4株临床常见非结核分枝杆菌标准菌株(快生型非结分枝杆菌鸟结核分枝杆菌ATCC25291、胞内分枝杆菌ATCC13950；慢生型非结分枝杆菌马赛分枝杆菌DSM45103；脓肿分枝杆菌ATCC19977)。药敏试验中的18个结核分枝杆菌按耐药类型分为2株全敏菌株(含标准菌株H37Rv)、4株异烟肼单耐药菌株、4株利福平单耐药菌株、4株耐多药(Multidrug-resistant，MDR)菌株和4株泛耐药(Extensively drug-resistant，XDR)菌株。除标准菌株外，均为我国临床分离菌株。

1.2试剂和耗材 抗结核药物购自美国Sigma公司；Middle brook 7H9 Agar、Mueller-Hinton Agar 和增菌液OADC购自BD公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司、Alarmar Blue 购自BIO-RAD公司；改良固体罗氏培养基购自珠海银科医学工程股份有限公司；薄层硅胶板 GF254、200-300目硅胶为中国青岛海洋化工集团公司产品；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、碘化铋钾等为国产分析纯试剂。

1.3 实验方法

1.3.1独山瓜馥木提取物的分离制备

1.3.1.1前处理 独山瓜馥木根采自贵州省独山县，经贵阳中医学院赵俊华教授鉴定。手工分拣、漂洗切块后，自然干燥，粉碎。

1.3.1.2一次提取 10 kg原药材，以6倍体积80%的乙醇，分批次回流提取；旋转蒸发仪(37 ℃)减压蒸馏回收乙醇提取液，50 ℃水浴浓缩蒸干。以10%的乙醇再溶解提取物后，分别用1.5 倍体积的石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷对提取物多次萃取至无色，旋蒸萃取液，得到3种一次萃取物。

1.3.1.3活性跟踪 将一次萃取物溶解，与罗氏培养基混合，制备成浓度为80 μg/mL的含药培养基；取3～4滴结核分枝杆菌BCG菌株(麦氏浊度1.0)的新鲜培养物接种至含药罗氏培养基斜面，37 ℃培养2～3周。菌落数≤5个视为有效。

1.3.1.4二氯甲烷提取物定性分析 将萃取出的二氯甲烷层点板进行薄层层析，二氯甲烷/甲醇(20/1)为展开剂展开完全后，用碘化铋钾显色剂均匀喷洒薄层。

1.3.1.5二次提取 对1.3.1.2中获得的二氯甲烷萃取物(组分1)进行二次分离纯化。200-300目硅胶柱，石油醚∶乙酸乙酯(7∶3)洗脱分离生物碱类成分，得到组分2；甲醇冲洗硅胶柱，冲洗液过大孔树脂，以50%乙醇为流动相分离苷类或者黄酮类成分，得到组分3。

1.3.2体外药物敏感试验

1.3.2.1菌液制备 分枝杆菌新鲜培养物，超声分散。结核分枝杆菌至麦氏浊度1.0，取400 μL菌液加入7.60 mL 的7H9 (10% OADC)培养基中，制成8 mL菌液备用；非结分枝杆菌至麦氏浊度0.5，取20 μL菌液加入7.98 mL MH (10%OADC)中，制成8 mL菌液备用(快生型非结不加OADC)。

1.3.2.2药液制备 药物用适宜的溶剂(水或DMSO)配制成51.2 mg/mL的储存液，再用相应的液体培养基2×倍比稀释成梯度浓度。实验药物的浓度范围为40～320 μg/mL，对照质控药物异烟肼和利福平为0.125～64 μg/mL，卡那霉素为1～128 μg/mL。

1.3.2.3药敏检测 取PCR8联管，每孔中加入相应备用菌液100 μL后，实验药物组再加入100 μL梯度药液，生长对照组再加入100 μL无药物的培养基。37 ℃培养。快生型非结在培养的第2 d，结核和慢长型非结在培养的第6 d开始在生长对照组的第一孔中加入70 μL Alarmar Blue显色剂，24 h之后观察变色情况。如显色液从蓝色变成紫红色或粉色，说明细菌已经生长，则在该菌株的实验药物组中每孔加入70 μL显色液。若生长孔未出现颜色变化，则依次每日在生长对照孔中添加显色剂，直至变色为止。最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)定义为实验药物组中显色剂颜色完全没有发生改变(即仍为蓝色)的最小药物浓度。每个菌株设3个重复，整体药敏试验重复2次。

2 结 果

2.1独山瓜馥木的提取物 10 kg原药材经乙醇提取后获得600 g提取物。一次提取分别获得80 g石油醚层、120 g乙酸乙酯层和120 g二氯甲烷层萃取物，其中二氯甲烷萃取物在活性跟踪实验中的菌落数是3个，显示其具有抗结核活性。二氯甲烷萃取物经薄层层析和碘化铋钾显色后出现橙红色斑点，说明二氯甲烷萃取物中为总生物碱类物质。二次提取分离，获得9.3 g组分2和20.2 g组分3。

2.2提取物的抗结核活性 中药相对毒性低，用量可以稍大，因此在本次实验中设置了40、80、120、160、200、240、280和320 μg/mL 8个浓度梯度。药敏实验结果显示(表1)，3种组分对非结分枝杆菌的MIC值都很高，在200 μg/mL以上，没有很好的抑菌效果。3种组分对结核分枝杆菌的MIC值明显低于非结分枝杆菌，都有一定程度的抑制作用，抑菌效果依次为组分2>组分1>组分3。值得注意的是，3个组分对耐药株，无论是单药耐药株，还是MDR菌株的抑制效果都优于全敏感菌株。尤其是组分2，其对43.75%(7/16)的耐药株的MIC值低于最小检测浓度。虽然组分3对3个菌株的MIC值为40 μg/mL，但可以看出它的抑菌效果比组分1差，因此在二氯甲烷萃取的基础上进行石油醚/乙酸乙酯萃取能进一步提纯抗结核有效成分，而50%乙醇的洗脱无效。

表1 独山瓜馥木根提取物3个组分药敏试验结果Tab.1 MIC of three extracted components of Fissistigma cavaleriei root

3 讨 论

结核病因为是胞内感染，干酪样病灶的疏水性等原因治疗困难，即使是敏感性结核病，用有效的一线药物治疗也需要6个月的疗程，而利福平耐药和耐多药结核病不仅疗程更长，经济负担更重(≥7 000元)，毒副作用更强外，治愈率仅有56%[7]。虽然当前有23个药物、14个候选疫苗及各种组合治疗方案处于临床试验阶段，鉴于目前结核病尤其是耐药结核病的全球流行形势，对抗结核新药的需求仍是非常迫切的。和西药相比，中药多采用汤剂口服的方式，较西药的毒副作用小，疗程长时病人的依从性也较好。且中药都不是单一化合物，尤其是按照君、臣、佐、史进行配伍使用中药方剂，其功效也不是单一的，在抗菌的同时，还可调节机体机能，有增强机体应激能力、自我修复能力和免疫力的作用，是综合性治疗。因此近年来，许多传统中药进入了抗结核药物研发的范畴，如苦参[6]和益母草[8]等。

独山瓜馥木(Fissistigmacavaleriei(Lev.) Rehd.)属于番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木属(Fissistigma)攀援灌木。瓜馥木属植物分布广泛，全株入药，具有祛风活血，镇痛的传统功效，用于治疗风湿骨痛，手足麻木，小儿麻痹后遗症，小儿惊风和骨折水肿。近年的研究发现拓展了瓜馥木类植物的作用。研究表明瓜馥木中的内酰胺碱可以抑制肺癌和多种实体瘤中肿瘤新生血管的增生，具有一定的抗肿瘤作用，且毒性低[9-10]。而瓜馥木中的总生物碱类以及氯仿萃取成分对香蕉炭瘟病菌(Glorospriummusαrum)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、梨褐斑病菌(Mycosphaerellasentina)、黑斑病菌(Alternariakikuchiana)、芒果叶枯病菌(Pestalotiacalabae)的等数种病原菌有明显的抑菌作用[11]。

本次研究的结果初步显示独山瓜馥木中除前期研究的没食子酸和β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯外，二氯甲烷提取的总生物碱成分也具有一定的抗结核活性。在进一步的研究中，我们将进行总生物碱成分的结构解析和扩大菌株量的更系统的体内外药效评价。与β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯促进休眠型结核分枝杆菌复苏的作用不同，总生物碱成分及结合石油醚/乙酸乙酯萃取进一步提纯的组分2对单耐菌株和耐多药菌株具有更好的抑制作用，在当下耐药结核病流行的严重形势下，这是其明显的优势。独山瓜馥木对结核分枝杆菌敏感和耐药菌株的作用差异也提示除已知的耐药机制外，还有其他未阐明的遗传因素差异在结核耐药中起作用。独山瓜馥木总生物碱的作用靶点及机制值得进一步研究，可能会给抗结核药物的研究提供新的靶点和途径，进而促进全球遏止结核病计划的实现。

利益冲突：无