模型化合物诱导木质素降解菌株烟曲霉Aspergillus fumigatus G-13的产酶特性

冯茜 燕红

摘要：以木质素酶活力作为指标，采用阿魏酸、对香豆酸和芥子酸3种模型化合物作为底物，通过添加纤维素及葡萄糖并改变培养方式，研究A。Fumigatus G-13诱导产酶特性。结果表明，摇床培养较静置培养菌株产酶能力提高了2-5倍;单独采用木质素模型化合物作为诱导物，芥子酸诱导作用最强，其LiP、Iac和MnP最大酶活分别可达24.08、21.67、110.78U/L;羧甲基纤维素、微晶纤维素和葡萄糖作为共底物，均对3种模型化合物对菌株的诱导能力起促进作用，其中葡萄糖的促进作用最为明显（较原酶活提高约1.38-5.34倍），羧甲基纤维素的促进效果优于微晶纤维素;且纤维素模型化合物和葡萄糖在诱导产酶方面起协同作用。

关键词：木质素模型化合物;诱导产酶;木质素酶;烟曲霉菌

DOI：10.15938/j.jhust.2020.02.021

中图分类号：O643.3;Q939.9文献标志码：A 文章编号：1007-2683（2020）02-0156-10

0 引言

木质纤维素具有来源丰富、数量多、价格低廉等优势。对解决当前人类所面临的资源短缺、环境污染等问题具有重大意义，但是木质素的天然结构极大地阻碍了其资源化利用与无害化处理。同时，就木质素生物降解机理而言，由于木质素结构复杂，其代谢途径、降解机制和相关酶酶学性质均尚未完全阐明，而木质素模型化合物因其简便易得、可有效代表天然木质素的典型结构和常作为木质素降解的中间代谢产物等特点，对木质素生物降解的研究及降解机理的揭示具有一定的理论意义。因此，化学结构已知的低分子量的简单木质素模型化合物（包括单体模型化合物、二聚体和三聚体等）和木质素改性化合物引起了世界范围内学者及研究机构的重视。陈红歌等发现木质素降解模式微生物黄孢原毛平革菌（phanerochaete chrysosporium）对木质素模型化合物阿魏酸有很好的降解作用，该菌与阿魏酸共培养2d后降解率可达99%以上。而张欢的研究表明，贪铜菌B-8（cupfiavidus B-8）在6d后对芥子酸的降解率可达到98.13%。但是，对采用纤维素模型化合物及葡萄糖作为共底物诱导微生物利用木质素模型化合物产木质素酶的报道极少，而常见天然木质纤维素，如水稻秸秆纤维素的含量高达51.6%。因此，本研究将3种木质素单体模型化合物阿魏酸、对香豆酸和芥子酸用于木质素生物降解的研究，以A。Fumigatus G-13为研究对象，检测以木质素模型化合物、纤维素共底物和葡萄糖为诱导底物得到的粗酶液的木质素酶活水平，分析比较木质素模型化合物种类、纤维素模型化合物种类及葡萄糖对A。Fumigatus G-13产木质素酶的诱导作用，为该菌株木质素降解酶的产生以及生物降解木质素的机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

可降解木质素的A。Fumigatus G-13，由实验室前期分离筛选并保存。

1.1.2 培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，琼脂20g/L，微量VB₁，加蒸馏水配成1000mL，自然pH值，120℃灭菌20min。

1.1.3 试剂配制

（1）大量元素营养盐溶液：KH₂PO₄0.2150g，（NH₄）₂SO₄0.2160g，MgSO₄·7H₂O 0.0073g，CaCl₂0.0150g溶解并定容至100mL，自然pH值。

（2）微量元素的营养盐溶液：CoCl₂·6H₂O 3.9g/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4g/L，MnSO₄·H₂O 1.6g/L与FeSO₄·7H₂O 5g/L，溶解并定容至1000mL，自然pH值。

1.1.4试验仪器及设备

TYXQ-LS-75S型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）、SW-CJ-1FD洁净台（上海博讯实业有限公司）、GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）、XSP-2CA光学显微镜（上海辰华）、SHZ-82A气浴恒温振荡器（金坛市荣华仪器制造有限公司）、SHZ-A水浴恒温振荡器（上海博讯实业有限公司）、电子分析天平（常熟市天量仪器有限责任公司）、离心机（上海安亭科学仪器厂）、紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任）。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

将保藏于4℃的A。Fumigatus G-13PDA培养基斜面取出，用无菌水将真菌斜面孢子冲下，制成10⁶个/mL（血球计数法测定）孢子悬液，4℃冰箱保存备用。

1.2.2试骏设计

样品编号对应的底物成分及培养方式见表l。木质素模型化合物分别为阿魏酸、对香豆酸和芥子酸，纤维素共底物为微晶纤维素和羧甲基纤维素。试验组1～6为静置培养方式，其中实验组1用于比较分析各木质素模型化合物对A。Fumigatus G-13产木质素酶的诱导作用;实验组2和3分别用于分析纤维素模型化合物微晶纤维素和羧甲基纤维素对各木质素模型化合物对A。Fumigatus G-13产木质素酶的诱导促进作用;实验组4用于分析葡萄糖对各木质素模型化合物对A。Fumigatus G-13产木质素酶的诱导促进作;实验组5和6分别用于分析同时添加纤维素模型化合物微晶纤维素或羧甲基纤维素及葡萄糖对各木质素模型化合物对A。Fumigatus G-13产木质素酶的诱导促进作。实验组7～12采用搖瓶培养方式，依次分别相对于实验组1-6对比分析培养方式对A。Fumigatus G-13产木质素酶作用。本研究采用液体培养，于250mL锥形瓶中加人大量元素营养盐溶液100mL和微量元素营养盐溶液0.1mL，木质素单体模型化合物浓度为0.1mmol/L，纤维素共底物和葡萄糖浓度均为10s/L，于120℃高压灭菌20min。后接人孢子悬液4mL，于30℃下进行培养，采用摇瓶培养时，摇床转速为160r/min，分别于培养第3、6、9、12、15d取样进行酶活测定。每组3个平行样。

由此可知，添加微晶纤维素作为辅助碳源，会促进阿魏酸和芥子酸诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶，但是会抑制以对香豆酸为诱导物G-13产木质素酶。

2.3 木质素模型化合物联合羧甲基纤维素诱导

A.Fumigatus G-13产木质素酶特性研究

图3（a）、3（b）和3（c）分别为阿魏酸+羧甲基纤维素、对香豆酸+羧甲基纤维素和芥子酸+羧甲基纤维素为底物诱导A。Fumigatus G-13产木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶活性在静置及摇瓶培养条件下随时间的变化曲线。在静置条件下，与仅以木质素模型化合物为底物诱导A。Fumigatus G-13产酶相比，添加羧甲基纤维素对酶活变化的趋势影响也很小，达到最大酶活时间不变。但酶活性会受羧甲基纤维素的添加所影响，以阿魏酸+微晶纤维素为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为24.13、15.09、123.98U/L;对香豆酸+微晶纤维素为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为21.66、14.18、121.89U/L;以芥子酸+微晶纤维素为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为31.22、31.05、187.43U/L。

在摇瓶培养条件下，酶活变化趋势与静置条件下相似，添加羧甲基纤维素使A。Fumigatus G-13产木质素酶能力不仅分别较仅以木质素模型化合物有所提高，而且较添加微晶纤维素也有所提高。由此可知，添加纤维素模型化合物作为辅助碳源，会促进3种模型化合物诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶，且羧甲基纤维素的促进作用更为明显。

2.4 木质素模型化合物联合葡萄糖誘导

A。Fumigatus G-13产木质素酶特性研究

图4（a）、4（b）和4（c）分别为阿魏酸+葡萄糖、对香豆酸+葡萄糖和芥子酸+葡萄糖为底物诱导A。Fumigatus G-13产木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶活性在静置及摇床培养条件下随时间的变化曲线。在静置条件下，添加葡萄糖作为辅助碳源与木质素模型化合物共同诱导A。Fumigatus G-13产酶时，酶活趋势保持不变，但是其诱导作用强于添加纤维素模型化合物。以阿魏酸+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为27.91、19.14、139.04U/L;对香豆酸+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为22.58、15.86、127.67U/L;以芥子酸+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为30.13、30.52、189.07U/L。

在摇瓶培养条件下，添加葡萄糖作为辅助碳源时，相较于样品仅以木质素模型化合物为诱导物，其酶活提高了3～5倍。具体来说：阿魏酸添加葡萄糖为底物的A。Fumigatus G-13液态发酵，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为不添加葡萄糖（即A-7组）所产酶活的3.75、3.98、3.21倍;对香豆酸添加葡萄糖为底物的A。Fumigatus G-13液态发酵，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别增长为B-7组酶活的3.97、4.05、3.91倍;而芥子酸添加葡萄糖则LiP、Lac和MnP活性分别为C-7组的2.20、3.84、4.28倍。且根据结果可知，在发酵的前6d，A-10、B-10和C-IO的酶活分别明显高于A-7、B-7和C-7，其可能的原因是葡萄糖的存在为菌株A。Fumigatus G-13发酵提供了易代谢碳源，使菌株能够在培养初期即可大量快速生长繁殖。燕红和袁俊超等人的研究表明，以葡萄糖为碳源时菌株能够产木质素降解酶，而同时添加葡萄糖和其他木质纤维素时，A。Fumigatus YS。ITBI产木质素酶能力提升显著。

通过对比可知，添加葡萄糖作为辅助碳源相比于添加纤维素模型化合物，对菌株产酶的促进作用更为明显（提高了约1.38～5.34倍）。同时，发现以芥子酸+葡萄糖为底物的A。Fumigatus G-13产木质素降解酶能力在摇床培养条件下显著提高，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为在相同底物条件下静置培养的1.11、1.47、1.41倍。比较添加葡萄糖和添加纤维素模型化合物为辅助碳源可知，添加葡萄糖作为辅助碳源，对于3种木质素模型化合物其对菌株产木质素酶的促进效果均好于纤维素模型化合物。其原因可能是葡萄糖的添加会大量刺激菌丝体生长，进而促进A。Fumigatus G-13产木质素降解酶。

2.5 木质素模型化合物联合微晶纤维素及葡萄糖

诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶特性研究

图5（a）、5（b）和5（c）分别为在静置或摇瓶培养条件下，木质素模型化合物阿魏酸+微晶纤维素+葡萄糖、对香豆酸+微晶纤维素+葡萄糖和芥子酸+微晶纤维素+葡萄糖为底物诱导A。FumigatusG-13产木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶活性随时间的变化曲线。在静置培养下，添加葡萄糖及微晶纤维素作为辅助碳源与木质素模型化合物共同诱导A。Fumigatus G-13产酶时，酶活变化显著，其诱导作用明显强于单独添加葡萄糖或微晶纤维素。以阿魏酸+微晶纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为36.38、25.90、171.23U/L;对香豆酸+微晶纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为24.06、19.26、137.69U/L;以芥子酸+微晶纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为47.46、48.45、265.40U/L。

在摇瓶培养条件下，3种诱导培养条件下A.Fumigatus G-13产LiP、Lac和MnP分别为相应底物条件下静置培养酶活的约1.9、2.1、2.6倍。对比同时添加葡萄糖及微晶纤维素和单独添加两者发现，其对A。Fumigatus G-13产木质素酶的诱导作用较两者的直接叠加增大约1.12（LiP）、1.34（Lac）、1.16（MnP）倍。结果表明，葡萄糖与微晶纤维素在影响木质素模型化合物产酶方面起协同作用。虽然马泽林等人在提高木质素生物降解方法的研究中表明，微生物对复杂碳源具有选择性利用的特质，但在本研究中该浓度下的辅助碳源和微晶纤维素的添加起协同作用而非碳代谢抑制（CCR）。

2.6 木质素模型化合物联合羧甲基纤维素及葡萄

糖诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶特性研究

图6（a）、6（b）和6（c）分别为在静置或摇瓶培养条件下，木质素模型化合物阿魏酸+羧甲基纤维素+葡萄糖、对香豆酸+羧甲基纤维素+葡萄糖和芥子酸+羧甲基纤维素+葡萄糖为底物诱导A。Fumigatus G-13产木质素过氧化物酶、漆酶和錳过氧化物酶活性随时间的变化曲线。静置培养条件下，添加葡萄糖及羧甲基纤维素作为辅助碳源与木质素模型化合物共同诱导A。Fumigatus G-13产酶时，酶活变化更为显著，其诱导作用也强于单独添加葡萄糖或羧甲基纤维素。以阿魏酸+羧甲基纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为44.68、29.61、139.58U/L;对香豆酸+羧甲基纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为29.18、22.51、126.33U/L;以芥子酸+羧甲基纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别为56.91、51.86、277.18U/L。

在摇瓶培养条件下，以阿魏酸+羧甲基纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别增长为同诱导物静置培养条件下的1.93、1.83、3.09倍;对香豆酸+羧甲基纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别增长为同诱导物静置培养条件下的2.63、2.45、3.47倍;以芥子酸+羧甲基纤维素+葡萄糖为诱导物，其LiP、Lac和MnP最大酶活分别增长为同诱导物静置培养条件下的2.34、2.11、1.97倍。而以芥子酸+羧甲基纤维素+葡萄糖为诱导物在摇床培养条件下，木质素模型化合物对菌株A。Fumigatus G-13产木质素酶的诱导能力最强，为133.17（9d）、109.61（12d）、548.71（12d）U/L，结果表明，葡萄糖与羧甲基纤维素在影响木质素模型化合物产酶方面起协同作用，而且其作用强于相应以葡萄糖和微晶纤维素为补充物的菌株产酶（诱导产酶能力增强约1.12-1.25倍（LiP）、1.02～1.30倍（Lac）和0.91～1.24倍（MnP）），这一结果与张佩佩利用细菌丝状丛毛单胞菌C35（Comamonas serinivorans C35）降解木质素模型化合物的研究相一致。

综上，添加葡萄糖或者纤维素模型化合物会对木质素模型化合物诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶产生影响，这2类物质的添加会对阿魏酸和芥子酸诱导产酶起促进作用，但是单独微晶纤维素添加作为补充碳源时，会抑制对香豆酸诱导A。FumigatusG-13产木质素酶。同时，辅助碳源的添加并不会改变模型化合物诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶的酶活趋势，也不会对三者诱导菌株降解木质素的能力产生颠覆性改变。张年磊的研究也印证了这一观点，即添加辅助碳源会对曲霉菌F-1（Aspergillus Sp。F-1）产木质素酶的活性产生影响但种类不会改变。即不论添加何种辅助碳源，就最大酶活而言，芥子酸诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶的能力强于阿魏酸强于对香豆酸。就3种木质素降解酶而言，辅助碳源的添加对Lac的影响最大，最大酶活提升至与Lip相当的水平甚至略高于Lip，但是仅以木质素模型化合物作为诱导物时，Lac大小仅相当于LiP活性的50%～75%。

3 结论

1）采用摇瓶发酵相比于静置发酵，对诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶更为有利。

2）采用芥子酸作为底物诱导菌株A。FumigatusG-13产木质素酶的能力最强，单独添加羧甲基纤维素的诱导作用强于微晶纤维素，但是弱于添加葡萄糖。

3）摇瓶培养条件下，同时添加葡萄糖及纤维素模型化合物会对木质素模型化合物诱导A。Fumigatus G-13产木质素酶起到协同作用。