可降解苯酚的厌氧产电菌株的分离筛选及生物学特性研究

李金达 易梦雯 王丽丽 付春娜 燕红

摘要：以含苯酚的厌氧段污水为底物构建微生物燃料电池（microbial fuel cell，MFC），从处于稳定期的MFC阳极分离筛选获得一株可降解苯酚的厌氧产电菌株A4.对菌株A4进行生理生化鉴定，表明该菌为肠杆菌。以菌株A4作为研究对象，探究了不同的氮源、碳源、pH值、温度、初始苯酚浓度、接种量及重金属离子对菌株生长同时对苯酚降解情况的影响。研究表明：最适氮源为NH₄NO₃，最佳共代谢基质为蔗糖，培养基初始pH值8，最佳初始苯酚浓度500mg/L，最适温度为23℃，接种量为10%。菌株A4可耐受一定浓度（0.2mg/L）的Pb²⁺，而对高浓度（2000mg/L）的苯酚耐受性降低。该菌株在生长的稳定期产电，测得64h时苯酚降解率达到67.37%，库伦效率（CE）为17.8%。研究通过选育优质的厌氧产电菌并优化其生长条件，在MFC处理含酚废水的应用上有重要意义。

关键词：苯酚降解;产电细菌;分离筛选;生物学特性;微生物燃料电池

DOI：10.15938/j.jhust.2020.02.020

中图分类号：0643.3;Q939.9文献标志码：A 文章编号：1007-2683（2020）02-0146-10

0 引言

苯酚是原生质类的芳香化合物，常被用作为化工产业的原料和反应的中间体。酚类化学结构稳定难于降解，直接排放会对生物体及环境造成严重危害。目前处理含酚废水的方法有物理法（吸附法、溶剂萃取法）、化学法（氧化法、沉淀法和光催化法）、生物法（活性污泥法、酶处理法）等。物理法和化学法适用于高浓度的含酚废水，且有投资高损耗大的缺点，而生物处理法处理含酚废水是一种低成本的环境友好型污染修复方式。近年来，微生物降解苯酚的研究中，从酚类污染的环境中筛选分离出来的苯酚降解菌有假单胞菌属（pseudomonas 3P。）、恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）、球形芽抱杆菌（6acillus sphaericus）、红球菌（rhodococcus Jp。）、根瘤菌（rhizobia。）、不动杆菌（acinetobacter sP。）、睾丸酮丛毛单胞菌（comamonas testoterone）、蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）等。

微生物燃料电池（MFC）是一种新型绿色废水处理技术，能够在处理废水同时利用微生物催化将有机物中的化学能转化成电能，从而引起了广泛关注。目前，使用MFC降解含酚废水的研究多集中于改变MFC的构型，而通过改变MFC的产电性能和影响苯酚降解的因素来改善电池的电压和苯酚降解率，获得纯的可降解苯酚的产电微生物为切入点的研究较为少见。在此，考虑到厌氧生物处理法有能耗低，负荷高的优点，将含苯酚的厌氧段工业废水样品为研究样品，从处于稳定期的MFC的阳极中分离纯化、筛选出可高效降解苯酚的厌氧产电微生物;对其进行鉴定，并对筛选出的菌株的生长条件和苯酚降解条件进行优化，以获得该菌株最适宜生长及苯酚降解的条件。最后应用于MFC中，从而取得更加优越的性能，也为酚类等难降解有机物的高效低耗处理提供思路。

1 材料

1.1污水样品来源

采自黑龙江省哈尔滨市文昌污水处理厂A²/O厌氧池的污水。

1.2 培养基

富集培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10s/L，NaCl5g/L，苯酚500mg/L，加蒸馏水配成1000mL，pH值调至7.2-7.4.

分离培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂18g/L，苯酚500mg/L，加蒸馏水配制1000mL，调节pH值至7.2～7.4.

无机盐培养基：KH₂PO₄3g/L，Na₂HPO₄6g/L，NaCl 0.5g/L，酵母膏0.2g/L，NH₄Cl 1g/L，CaCl₂0.011g/L，FeSO₄0.025g/L，MgSO₄0.24g/L，苯酚500mg/L。

厌氧液体培养基：胰蛋白胨4.0g/L，牛肉浸膏4.0g/L，酵母膏1.0g/L，CaCl₂0.2g/L，NaCl 5.0g/L，乙酸鈉16.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，MgCl₂0.2g/L，K₂HPO₄1.2g/L，半胱氨酸1.0g/L，柠檬酸铁5.0mmol/L和刃天青0.4mL/L，调节pH值为7.

厌氧固体培养基：胰蛋白胨4.0g/L，牛肉浸膏4.0g/L，酵母1.0g/L，CaCl₂0.2g/L，NaCl 5.0g/L，乙酸钠16.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，MgCl₂0.2g/L，K₂HPO₄1.2g/L，半胱氨酸1.0g/L，柠檬酸铁5.0mmol/L和刃天青0.4mL/L，琼脂18g/L，调节pH值为7.

1.3 电极缓冲液

阴极缓冲液：Na₂HPO₄2.75g/L，NaH₂PO₄4.22g/L，KMnO₄200mg/L。

阳极缓冲液：NH₄Cl 1.5g/L，MgCl₂·6H₂O 0.1g/L，CaCl₂0.1g/L，KH₂PO₄0.1g/L。

3.3.2 碳源对菌株生长和苯酚降解的影响

苯酚可作为菌株A4的碳源，而外加碳源可以促进菌株生长和增强苯酚降解率，使降解时间缩短。本研究分别采用蔗糖、乳糖、葡萄糖和乙酸钠作为外加碳源进行实验，经48h的培养发现如图6（a），乳糖对菌株生长促进作用最为明显，OD60达到0.73.其次为蔗糖，OD₆₀₀为0.68.如图6（b）所示，当添加外加碳源为蔗糖时，菌株苯酚降解率最高，可达到29.5%。可能原因是蔗糖与菌株降解苯酚具有共代谢的作用。综合菌株的生长情况、苯酚降解率和经济效益考虑，选择蔗糖作为菌株对苯酚降解的最佳碳源。

3.3.3 初始pH值对菌株生长和苯酚降解的影响

培养基的初始pH值在微生物的生长及有机物的降解的过程中具有重要影响。如图7（a）所示，随着初始pH值增长，菌株A4的生长量呈现先上升后下降的趋势。研究表明，菌株A4适应弱碱性的环境生长，最适合菌株生长的初始pH值为8.如图7（b），当pH值为8.0时，菌株苯酚降解率最高，在此PH条件下培养48h，该菌株对苯酚的降解率达50%。综上分析，选择pH值为8作为菌株A4的最佳初始pH。

3.3.4 接种量对菌株生长和苯酚降解的影响

接种量对菌株的生长量和苯酚降解率的影响如图8所示。随着接种量增加，延滞期逐渐缩短，营养物质消耗率增加，苯酚降解率也随之增大。接种量为2%一5%时，由于菌量较少，营养充足，菌株繁殖速度较快。当接种量为10%时，菌株生长量和苯酚降解效率分别为0.35和23.58%，高于接种量为1%（0.17和12.53%）、5%（0.28和21.36%）及20%（0.28和14.61%）。接种量为10%时，菌株生长量OD₆₀₀为0.35，而接种量超过10%，OD₆₀₀急剧下降，并且细菌对苯酚的降解能力也显著减弱。原因是当接菌量较高时会形成碳源竞争，抑制菌株的繁殖，影响降解速率。综合考虑选择10%作为菌株A4的最佳接菌量。

3.3.5 温度对菌株生长和苯酚降解的影响

生物法处理废水过程中，温度与菌体的酶活力密切相关，在适宜的温度范围内，微生物的生理活动旺盛，有助于提高其对有机污染物的氧化降解和合成代谢能力。由图9可以看出，当培养温度达到37℃时，OD₆₀₀值为1.059，生长量达到最大;但此温度条件下，菌株对苯酚的降解率为16.82%，明显低于23搜索点对苯酚的降解率，并且菌株的苯酚降解率随着温度的增加而减小。所以37℃为菌株A4生长的最适温度，而23℃为该菌株降解苯酚的最适温度。

3.3.6 初始苯酚浓度对菌株生长和苯酚降影响

工厂排放废水中有时苯酚的含量过高，能否耐受高浓度的苯酚，是衡量菌株实际应用条件的重要性能指标。因此本研究针对菌株A4对高浓度苯酚的耐受性进行了研究。本实验设置的初始苯酚浓度分别是500mg/L、1000mg/L和2000mg/L。研究表明，如图10所示，在500mg/L的苯酚废水中A4的生长情况最好，此时的苯酚浓度最有利于对苯酚的降解。随初始苯酚浓度的提高，该菌株的生长明显受到了抑制，当苯酚浓度达到2000mg/L时，该菌株对苯酚的降解能力几乎消失，说明菌株A4不适合在较高浓度的苯酚下应用。

3.3.7 金屬离子对菌株生长和苯酚降解的影响

图11表示4种重金属离子Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺，每种金属离子质量浓度分别为0.01mg/L、0.02ms/L、0.05m8/L、0.1mg/L、0.2mg/L和0.4mg/L时，对菌株A4的生长量和苯酚降解率的影响。由图11（a）看出，4种重金属离子中，菌株对Pb²⁺的耐受能力最强，48h测得OD₆₀₀达到0.4，对Co²⁺和Cu²⁺次之，而菌株对Cd²⁺的耐受能力最弱。随着4种重金属离子浓度不断增长，菌株的生长呈现出不同情况。当浓度超过0.05mg/L时，菌株对Co²⁺、Cd²⁺及Cu²⁺的耐受性随浓度增加逐渐减弱。而菌株A4对Pb²⁺的耐受性则呈现先增长后降低的趋势，在浓度为0.2mg/L时OD₆₀₀达到最大值。

由图11（b）可见，Cd²⁺、Co²⁺和Pb²⁺浓度从0.01mg/L升高到0.4mg/L过程中，对苯酚降解率的抑制作用不断增强，其中，Cd²⁺作用最为明显，48h苯酚降解率下降了15.70%。而Pb²⁺对苯酚降解的促进作用最强，当浓度达到0.2mg/L时，菌A4对苯酚的降解效率达到最高水平。由此可以看出，菌株A4可耐受一定浓度的Pb²⁺，在高浓度的Pb²⁺（0.2mg/L）存在时，菌株A4仍保持较高的苯酚降解能力。

3.4 产电特性初步探讨

3.4.1 菌株A4构建的MFC

葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（500mg/L）作为基质，将菌株A4接种到阳极，启动MFC，验证菌株的产电能力。运行的结果如图12所示。菌株A4在MFC中运行大致可以分为两个时期，分别为电压快速上升期和相对稳定期。启动电压为0.66V，经历约125h的电压的快速增长后，电压趋于平稳，在124h处达到最大电压718mV。培养基更换后，电压快速增加，可能是由于阳极表面已经形成的生物膜在MFC中起重要作用。更换3次培养液，在157h处达到电压相对稳定期。随着电池的运行，电压在稳定期的数值与峰值行的差距逐渐缩小，这可能是由于菌体自身分泌氧化还原性物质，从而有效增加了电子的传递速率。

陈柳柳等研究表明，葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（200mg/L）作为燃料，MFC的库伦效率达到7.2%。骆海萍等研究发现，利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（600mg/L）作为燃料，MFC的库伦效率可达到2.3%。范平等利用苯酚（600mg/L）为底物的MFC库伦效率为1.47%。通过构建MFC的苯酚降解曲线直观显示持续降解能力。本研究结果（见图13）表明：将菌株A4接种到含苯酚（500mg/L）MFC中，苯酚降解率随着时间的增加而逐渐升高。在64h时苯酚降解率达到最大值67.37%，随后出现下降趋势的趋势，经计算库伦效率为17.38%。本文中菌株A4利用MFC降解苯酚，降解率较低于近几年文献报道的其他菌株，其可能原因是阳极室中存在其他非产电细菌，MFC运行过程中能观察到阳极室上方有气体的累积，有机物水解酸化导致溶液pH值降低，而该菌株较适宜在弱碱性环境中降解苯酚。而库伦效率高于其他的以苯酚为燃料的微生物燃料电池。库伦效率是反映MFC降解有机物用来产电部分所占的比例，库伦效率越大，电池能量的转化率越高。陈柳柳等利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（200mg/L）作为燃料，MFC的库伦效率达到7.2%。骆海萍等利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（600mg/L）作为燃料，MFC的库伦效率可达到2.3%。范平等仅利用苯酚（600ms/L）为底物的MFC库伦效率为1.47%。因此，在能量转化效率方面，利用菌株A4构建的MFC具有一定优势。

3.4.2 菌株产电循环伏安分析

探究菌株不同生长时期的产电性，对菌株培养条件的优化具有十分重要的意义。使用循环伏安法测定菌种是否具有电化学活性，图14为菌株A4培养的循环伏安曲线图。含有菌株A4的曲线在稳定期有一对氧化峰和还原峰，氧化峰位于-0.7mV--0.3mV，还原峰在0.5mV～0.7mV附近，这说明该菌株具有产电活性，且菌株在稳定期产电。

3.4.3 阳极碳毡扫描电镜分析

图15为利用SEM观察到的生物膜及A4菌体形态。MFC中阳极碳毡具有相互交叉的网状结构，这种结构有利于菌株A4的附着生长，从而易于形成生物膜。图15（c）为MFC运行300h后碳毡放大5000倍的SEM图，阳极表面附着了大量杆状菌体细胞，生长较为致密，为菌株A4产电能力提供了直观证据，其细胞膜外没有观察到类似纳米导线的的衍生结构，菌株只是与电极接触。猜测菌株A4可能通过分泌某些氧化还原介体促进电子在微生物中进行传递。

4 结论

1）本研究从厌氧池的污水中利用处于稳定期的MFC阳极分离、纯化、筛选出可降解苯酚的厌氧产电菌株A4，并对其进行分类鉴定为肠杆菌。

2）对菌株A4的生长和苯酚降解条件进行优化，获得最适菌株生长及对苯酚降解的条件：NH₄NO₃为最佳氮源;最佳共代谢基质是蔗糖;最佳初始pH值为8;最佳温度为23℃;最适接种量10%。菌株A4可耐受一定浓度（0.2mg/L）的Pb²⁺，而对高浓度（2000mg/L）的苯酚耐受性降低。

3）菌株A4在生长的稳定期产电，在優化的条件下，利用葡萄糖（1000mg/L）和苯酚（500mg/L）作为燃料构建的MFC中，最大电压达718mV，对苯酚的降解率达到67.37%，库伦效率为17.8%。利用该菌株构建的MFC可高效降解苯酚，同时在能量转化效率方面也具有明显的优势。