日照海域牡蛎共生真菌的分离、鉴定及生物活性研究*

王焕南 赵 艳 王向月 杨 莹 尹楠楠 张 震△

(1济宁医学院药学院，日照 276826；2日照中心医院，日照 276800)

海洋约占地球表面积的71%，是巨大的生物资源库[1-2]。海洋微生物是生物活性代谢物最丰富的来源之一[3]，其中海洋真菌产生的次级代谢产物分子质量相对较小，但活性优良，多数化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)、免疫抑制和酶抑制等作用[4-5]。同时，海洋真菌具有可大规模人工培养，生长周期短，种类丰富，来源广等优势，其次生代谢产物具有开发药物先导化合物的巨大潜能[6-7]。

AD是一种常见的老年性脑神经退行性病变，随着世界人口老龄化不断增加，AD的患病率也显著增加[8-9]。在世界范围内，AD已成为老年人死亡的主要原因之一。临床上，用于AD治疗的药物，包括胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，只能在有限的时间内抑制痴呆症状，但不能阻止或逆转疾病进展。本研究基于内共生理论，从日照海域野生牡蛎中分离其内共生真菌，通过对菌株代谢产物HPLC分析、体外抗氧化活性和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定，以期得到具有代谢产物丰富、生物活性显著的菌株，为进一步研究其次级代谢产物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工公司)；葡萄糖(上海国药公司)；琼脂粉(青岛海博生物公司)；DTNB、ATCIAChE、DPPH均购自上海源叶；卧式恒温震荡培养箱(上海知楚公司)；洁净工作台(苏州安泰公司)；EYELA旋转蒸发仪(上海爱朗公司)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔公司)；多功能微孔板检测仪(美国伯腾公司)；立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯公司)；恒温培养箱(宁波江南公司)；PCR扩增仪(美国伯乐公司)；电泳仪(北京六一公司)。

1.2 方法

1.2.1牡蛎内生真菌的分离与鉴定 样品来源：牡蛎样品采集于日照王家皂附近海域(东经119.45°，北纬35.42°)，选取新鲜野生牡蛎2h内处理；实验用海水来自日照海域，pH为6.72。

PDA培养基配制：土豆20g，葡萄糖2g，琼脂1.5g，配制成100ml培养基。

PDB培养基配制：土豆20g，葡萄糖2g，配制成100ml培养基。

参照文献[10]将牡蛎表面清洗后，撬壳取肉，用75%乙醇浸泡软体10s后，无菌海水冲洗3遍，剪碎，摇床振荡，过滤得菌悬液，梯度稀释。将稀释的菌悬液涂布在PDA上，置于恒温培养箱28 ℃培养。定期观察菌落的生长情况，根据生物形态学区分并及时分离、纯化，直至得到形态单一的菌落。

将纯化好的菌株在液体培养基内恒温震荡培养(30℃，150r/min)，直到长出足够大小的球状菌体，根据UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，采用18S序列通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)对真菌DNA进行PCR扩增，凝胶电泳检测、测序。将测序得到的DNA序列提交到NCBI的GenBank数据库，通过BLAST比对，构建系统发育树，确定菌株的种属。

1.2.2菌株次级代谢产物的提取 挑取纯化的菌株，置于PDB培养基中，30℃、150r/min震荡培养，发酵10d，离心得上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩得粗浸膏。

1.2.3抗氧化活性测定 DPPH反应溶液：0.4mmol/L DPPH，10mg/ml抗坏血酸溶液，10mg/ml样品溶液。

按照表1配置空白组、阳性对照组、阴性对照组、样品组、样品本底组，避光操作。加样后，将96孔板震荡30min，用酶标仪在517nm处测得OD值，根据下列公式[11]计算其清除率。

表1 DPPH法各组加样量/μl

1.2.4AChE抑制活性测定 ACHE活性测定溶液：500ml PB缓冲溶液(pH=8.0)；0.1mmol/L ATCI；0.0667mmol/L DTNB；0.05μ/ml AchE；0.4% SDS；阳性对照：盐酸多奈哌齐(Donepezil)。

在5ml EP管中按照表2分别配置拟完全抑制组、标准组、样品组、样品本底组，避光操作，将反应液于37℃水浴260s后，加入SDS终止反应。在412nm处酶标仪测得OD值，根据下列公式[12]计算其抑制率。

1.2.5HPLC分析 将得到的浸膏用甲醇溶解，配制浓度为10mg/ml。色谱条件：色谱柱为WondaSil C18 Superb 4.6250mm，5μM；流动相为甲醇(A)-水(B)梯度洗脱；进样量为20μl；流速为0.8ml/min；柱温为30℃；检测波长为190～780nm。

表2 Ellman法各分组加样量/μl

2 结果与分析

2.1 形态学分析

从日照海域采集的野生牡蛎，对其进行清洗，处理后得到菌悬液，将菌悬液梯度稀释后，涂布在PDA培养基上。根据菌落颜色及形态分离纯化出17种内生真菌，其形态如图1所示。

图1 1～17号真菌形态学图

2.2 菌株分子鉴定

对1～17号菌株的DNA进行PCR扩增，并将5μl PCR产物进行凝胶电泳，其余送苏州金唯智生物公司测序，将测序得到的DNA序列提交到NCBI的GenBank数据库，通过BLAST比对，构建分子系统发育树，结果如图2所示。

系统发育树并结合菌株形态，确定Y-1菌株为青霉菌属(Penicilliumsp.)；Y-2、Y-6、Y-9和Y-13为丝衣霉菌(Byssochlamyssp.)；Y-3和Y-7为链格孢菌属(Alternariaalternata)；Y-4为篮状菌属(Talaromycesradicus)；Y-5为黄曲霉(Aspergillusflavus)；Y-8和Y-11为红曲霉(Aspergillusruberstrain)；Y-10和Y-17为芽枝孢霉菌(Cladosporiumperangustumstrain)；Y-12为宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotiistrain)；Y-14为绳状篮状菌属(Talaromycesfuniculosusstrain)；Y-15为聚多曲霉(Aspergillussydowii)；Y-16为姬松茸，蘑菇科真菌(Agaricaceaesp.)。

图2 1～17号菌株基于18S序列构建系统发育树

2.3 代谢产物的生物活性测定

2.3.1体外抗氧化活性 当样品终浓度为200μg/ml，1～17号菌株代谢产物浸膏均有一定的抗氧化活性，其中，Y-6、Y-8、Y-11抗氧化活性最强，对DPPH自由基清除率分别为33.62%、38.79%和48.27%。其次为Y-1、Y-5、Y-9、Y-13，其代谢产物对DPPH自由基清除率为14.58%～19.96%，阳性对照Vc清除率为94.30%。见图3。

图3 1～17号菌株的代谢产物对DPPH自由基的清除作用

2.3.2体外AChE抑制活性 牡蛎共生真菌代谢产物抑制AChE活性结果如图4所示。样品终浓度为200μg/ml，大部分菌株代谢产物浸膏对AChE均有一定抑制作用，其中，Y-1、Y-8、Y-11抑制作用较强，其抑制率分别为33.78%、39.20%、40.98%(Donepezil为阳性对照，抑制率为65.88%)。

图4 1～17号菌株的代谢产物对AChE活性的抑制作用

2.4 HPLC分析

根据代谢产物浸膏的液相色谱(254nm)分析可知，Y-1、Y-5、Y-6、Y-8、Y-11、Y-14、Y-15等几株菌株的代谢产物相对丰富，其他菌株的代谢产物比较单一。17株真菌在保留时间17min左右均有一高的色谱峰，推测此化合物可能是野生牡蛎内生真菌的共性化合物。结合菌株代谢产物的生物活性测定可知，生物活性相对较好的菌株其代谢产物的丰富度也较高。

图5 1～17号菌株代谢产物的HPLC分析

3 结论

本研究从日照海域野生牡蛎中分离纯化得到17株内生真菌，根据形态学和DNA分子鉴定结果表明，Y-1菌株为Penicilliumsp.(青霉菌属)；Y-2、Y-6、Y-9和Y-13为Byssochlamyssp.(丝衣霉菌)；Y-3和Y-7为Alternariaalternata(链格孢菌属)；Y-4为Talaromycesradicus(篮状菌属)；Y-5为Aspergillusflavus(黄曲霉)；Y-8和Y-11为Aspergillusruberstrain(曲霉)；Y-10和Y-17为Cladosporiumperangustumstrain(芽枝孢霉菌)；Y-12为Paecilomycesvariotiistrain(宛氏拟青霉)；Y-14为Talaromycesfuniculosusstrain(篮状菌属)；Y-15为Aspergillussydowii(聚多曲霉)；Y-16为Agaricaceaesp.(姬松茸，蘑菇科真菌)。对所有菌株的代谢产物浸膏进行DPPH自由基清除作用和抑制AChE活性测定，结果表明多数菌株的代谢产物具有一定的抗氧化活性和抑制AChE活性，其中，Y-8和Y-11的代谢产物的活性较为显著，浓度为200μg/ml时，对DPPH自由基清除率分别达38.79%和48.27%，对AChE活性抑制率分别达39.20%和40.98%，同时Y-8和Y-11的次级代谢产物具有较高的丰富度。因此，本研究基于内共生理论得到了两株代谢产物丰富、生物活性显著的菌株(AspergillusruberstrainY-8和Y-11)，为进一步挖掘新型抗AD的先导化合物奠定了基础。