低温对雄性大鼠生殖功能的影响*

高 波 赵一帆 郑春晓 田珊珊 黄志诚

(1济宁医学院药学院，日照 276826；2济宁医学院基础医学院，济宁 272067)

职业因素与环境因素是造成男性不育的重要原因[1]。高温、电磁辐射以及多种化学毒物可影响雄性动物或男性的生精作用和生殖功能[2-5]。低温是常见的职业性物理性有害因素，可对作业工人身体造成神经系统、心血管系统、消化系统、内分泌系统功能的损伤[6-8]。目前，国内外关于低温对雄性生殖功能影响的研究报道较少。本课题对雄性大鼠进行了为期45d的低温实验，并对实验后大鼠的生殖功能进行了研究，旨在为低温对机体损伤的全面评价及其对雄性生殖功能的影响提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物与分组 Wister大鼠36只，雄性，体重180～220g。将其随机分为高、中、低暴露组和对照组，中、低暴露组和对照组每组8只，高暴露组12只(其中4只用于睾丸超微结构的观察)。所有大鼠由专人进行管理饲养，自由饮食，除实验因素外，各剂量组与对照组的生活环境相同。

1.1.2主要试剂与仪器 大鼠睾酮(testosterone，T)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)、大鼠促黄体生成素(luteinizing hormone ，LH)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；全自动酶标仪EXL808(美国，伯腾仪器有限公司)、LKB-V型超薄切片机(瑞典LKB公司)、JEOL-1200EX射透电镜(日本JEOL公司)。

1.2 方法

1.2.1低温实验 所有大鼠在实验室适应14d后开始实验。利用本地区11月末到第二年1月初的自然气候特点，将关闭暖气的实验室作为低温实验室。实验过程中，每隔2h观察房间气温，通过开空调或开窗，将气温控制在0～5℃的范围内。低、中、高暴露组低温实验时间分别为6、12、24h/d，其余时间置于20℃的实验室内，实验总时间为45d。对照组在整个实验过程中均置于20℃的实验室内。

1.2.2大鼠血清T与LH浓度的测定 低温实验结束后，采用摘眼球取血的方法，取各组大鼠的血液并分离血清，置于-80℃的冰箱中待测。大鼠血清T、LH用ELISA法进行测定，按试剂盒说明书的步骤操作。

1.2.3精子质量测定 取血结束后，立即取双侧附睾，并置于1ml 37℃的生理盐水中剪碎，使其充分释放精子，制成精子悬浊液，并涂片进行观察，计算精子活动率。根据精子运动活动标准，将精子的活动力分为4个级别，活动力较好的3个级别精子占所有进行观察精子的百分比，即为精子活动率。同时将另一涂片进行伊红染色，观察并记录1000个精子中的精子畸形率。之后将精子悬浊液置于60℃的水浴中使其死亡，用红细胞计数板观察并计算精子数量。

1.2.4睾丸超微结构的观察 只对高暴露组进行睾丸超微结构的观察。将大鼠麻醉后，经左心室进行动物灌注液灌注。灌注后，取厚度为1mm的睾丸组织，用PB快速冲洗，立刻放入3%戊二醛固定液内(pH=7.4)；按常规TEM样品制备法依次进行漂洗、1%锇酸(OsO4)固定、漂洗、脱水、浸透、Epon812包埋；半薄切片定位后，用LKB-V型超薄切片机进行超薄切片；柠檬酸铅和醋酸铀电子染色。将标本放于JEOL-1200EX透射电镜下观察，MORADA-G2记录。

1.3 统计学方法

使用SPSS23.0软件对实验数据进行统计描述及统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两之间比较使用Bonferroni检验、Dunnett-t检验。检验水准α=0.0125。

2 结果

2.1 动物一般情况

低温处理后的高、中、低暴露组大鼠均出现食欲下降，活动减少等表现，高暴露组的表现最为明显。各组均无大鼠死亡。

2.2 大鼠血清T和LH的测定结果

各暴露组与对照组大鼠血清T与LH的浓度在总体上具有显著性差异(P<0.05)。与对照组比较，3个低温暴露组大鼠血清T浓度显著下降(P<0.01)；高暴露组大鼠血清LH浓度较对照组和低暴露组显著降低(P<0.01)。见表1。

组别nTLH对照组865.76±27.70169.83±38.91低暴露组844.43±7.92*180.63±31.77中暴露组843.61±6.92*150.69±18.21高暴露组837.66±5.78*122.76±16.74*#F值6.653.50P0.000.04

注：与对照组比较，*P<0.01；与低暴露组比较，#P<0.01

2.3 各组精子质量测定情况

各组精子计数、精子活动度、精子畸形率在总体上均呈显著性差异(P<0.05)。与对照组比较，高暴露组精子计数、精子活动度及中暴露组精子活动度均显著降低(P<0.01)；高暴露组、中暴露组的精子畸形率均显著增高(P<0.01)。见表2。

表2 各组精子质量比较

注：与对照组比较，*P<0.01

2.4 睾丸超微结构

高暴露组大鼠睾丸超微结构结果显示，曲细精管管腔面未发现成熟精子，只能看到鞭毛横断面，且线粒体未聚集在鞭毛处(可导致鞭毛运动失去动力)；支持细胞胞质内出现空泡、支持细胞有肿胀；细胞内出现2个自噬小体：分别呈现环状线粒体包绕与双层膜包绕状态，内含脂质结构、髓样结构及膜性结构。见图1。

注：A.曲细精管管腔面，未见成熟精子，只能看到鞭毛横断面，线粒体未聚集在鞭毛处以协助鞭毛运动；

B.曲细精管管腔面，大量鞭毛聚集，未见成熟精子；

C.支持细胞，细胞质内出现空泡，有肿胀现象；

D.睾丸支持细胞，异常肿胀；

E.细胞核附近出现双层膜结构的自噬小体

图1 高暴露组睾丸超微结构

3 讨论

T是主要由睾丸间质细胞产生并释放的性激素，其主要功能是刺激雄性内外生殖器的分化、成熟和发育，同时对骨骼、骨骼肌、毛发和皮肤的生长具有激发或促进作用[9-10]。睾丸分泌T的条件之一是适宜的温度。LH是下丘脑-垂体-性腺轴中由垂体细胞分泌的一种促性腺激素，对于雄性个体，它可促进睾丸间质细胞合成和释放T的能力。本文结果显示，低、中、高低温暴露组大鼠血清T浓度均显著低于对照组，表明长时间低温降低了睾丸间质细胞产生和释放T。T的产量下降，会对下丘脑-垂体-性腺轴产生反馈，使垂体细胞分泌LH增多以促进T的合成，因此，本研究中低暴露组大鼠血清LH浓度较对照组增高。但随着在低温条件下暴露时间的延长和低温强度的加大，这种反馈机制可能受到损害，从而引起下丘脑-垂体-性腺轴的损伤。这可能是高暴露组大鼠血清LH浓度出现下降的原因。与生殖激素相对应的精子质量的检测也显示出一致的结果，表现为高暴露组与中暴露组的精子计数、精子活动度、精子畸形率较对照组均出现明显异常。

高暴露组电镜观察结果显示，在曲细精管的管腔面，未发现成熟精子，只观察到鞭毛的横断面。线粒体数目、形态虽正常，但并未聚集在鞭毛周围来协助其运动。其原因，可能是低温环境会抑制线粒体等细胞器的活性，使线粒体不能为鞭毛的运动提供动力。而低温会导致T的水平下降，使睾丸的生精功能受到限制，无法形成成熟的精子。支持细胞是生精上皮的一部分，可分泌多种物质，为生精细胞提供营养，并参与转化激素及吞噬作用等[11-12]，在精子生成的整个过程中都发挥重要的作用。支持细胞的另一个功能是，产生雄激素结合蛋白，这种结合蛋白能够维持曲细精管内的雄激素水平，有利于更多精子的成熟。本文结果显示，睾丸支持细胞胞质内出现大而亮的圆形空泡，并伴有支持细胞肿胀现象的发生，提示低温造成支持细胞的损伤。自噬小体是包含胞质在内的与衰老细胞、死亡细胞降解相关的物质，是一种封闭的、类圆形的小体结构[13]。细胞通过自噬清除受损、衰老的细胞器来为细胞的修复、重建提供原料，实现胞质内物质的循环利用[14]。在正常情况下，睾丸生精细胞内自噬小体较少，自噬水平较低。本研究中，在一个生精细胞中出现了2个自噬小体，可能提示在低温作用下，细胞衰老或细胞受损的细胞器增多导致细胞自噬功能增强。同时，高暴露组超微结构所显示的成熟精子较少、线粒体异常分布、自噬小体增多(自噬功能增强)等与高暴露组精子计数明显、精子活动度明显降低等表现也呈一致性。

总之，从性激素测定、睾丸病理学观察，到精子质量的检测，均提示低温可影响雄性大鼠的生殖功能。低温对雄性大鼠生殖功能产生影响的深层次机制，以及低温是否造成人类男性生殖功能的异常，尚需进一步研究。