基于HPLC 法测定秦艽-威灵仙药对水煎液的环烯醚萜苷类成分

吴 晨，魏 昀，高慧琴

（甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州730000）

秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）为龙胆科植物秦艽的干燥根，威灵仙（Clematis chinensis Osbeck.）为毛茛科植物威灵仙的干燥根和根茎［1］。秦艽和威灵仙二药均具有祛风湿之功效［2］。环烯醚萜类化合物苷元具有抗炎、止血、镇痛等功效，可分为獐牙菜苦苷类、龙胆苦苷类和獐牙菜苷类等［3-4］。本研究首先通过网络药理学检索秦艽-威灵仙药对中含有的环烯醚萜苷类有效成分，接着通过高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）对秦艽-威灵仙药对水煎液成分进行分析，最终将色谱分析结果与网络药理学检索结果进行比对，判断通过网络药理学检索秦艽-威灵仙药对水煎液成分结果的准确性，为网络药理学相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 软件数据库

中药系统药理学分析平台［5］（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 和 Cytoscape 3.2.1 分析软件（https：//cytoscape.org）。

1.2 药品与试剂

秦艽和威灵仙饮片购自兰州惠仁堂药店，批号分别为16062901 和16061406，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李成义教授鉴定为正品。标准对照品：獐牙菜苦苷（批号：CHB181105）、龙胆苦苷（批号：CHB190130）和獐牙菜苷（批号：CHB180115），纯度均≥98%，购自成都克洛玛生物科技有限公司。甲醇（色谱纯）购自美国Sigma公司；磷酸（色谱纯）购自天津大茂化学试剂厂；蒸馏水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1.3 实验仪器

1260 系列高效液相色谱仪配 G7115A DAD检测器（美国Ailent Technologies 公司）；KQ-700DE型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E 型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 国际贸易上海有限公司）；MYB 型电子调温电热套（天津市中实验电炉有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 药对活性成分筛选与收集 依次以“秦艽”和“威灵仙”为关键词通过 TCMSP 数据库检索各味药的活性成分，以生物口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18 作为筛选标准［6］，汇总整理秦艽-威灵仙药对的活性成分，并通过Cytoscape 构建“中药-成分”网络拓扑图，筛选环烯醚萜苷类成分。

1.4.2 色谱条件 色谱柱为：安捷伦883975-902 ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相 A 为 0.04%磷酸水溶液（0～28 min，85%A→77%A；28～35 min，77%A→65%A）、流动相 B 为甲醇，色谱柱采用梯度洗脱（0～28 min，15%B→23%B；28～35 min，23%B→35%B）；流速设置为 0.8 mL/min；柱温箱设置为30 ℃；检测波长设置为245 nm；进样量设置为 5 μL。

1.4.3 标准对照品和药品的制备 标准对照品溶液的制备：分别精密称取獐牙菜苦苷5.0 mg、龙胆苦苷10.6 mg 和獐牙菜苷3.1 mg，分别置于3 个10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得对应高浓度标准对照品溶液。

混合标准对照品溶液的制备：分别精密量取1 mL 獐牙菜苦苷、1 mL 龙胆苦苷和1 mL 獐牙菜苷标准对照品溶液，置于1 个10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得混合标准对照品溶液。其浓度分别为：獐牙菜苦苷0.050 0 mg/mL、龙胆苦苷0.106 0 mg/mL 和獐牙菜苷0.031 0 mg/mL，置于4 ℃冰箱储存备用。

通过冷凝回流法制备秦艽-威灵仙药对水煎液，按照秦艽：威灵仙1∶1 的比例分别称取秦艽饮片和威灵仙饮片各5 g 共10 g，分2 次煎煮。第1次加 10 倍量水（100 mL），浸泡 30 min 后，加热至沸腾后再煎煮1 h，纱布过滤收集药液；第2 次加8倍量水（80 mL），加热至沸腾后再煎煮30 min，纱布过滤收集药液，合并浓缩2 次水煎液，定容至100 mL，得到浓度为0.1 g/mL 的秦艽-威灵仙药对水煎液。将以上制得中药水煎液通过0.45 μm 滤器过滤，置于-20 ℃冰箱储存备用。

1.4.4 适应性实验 设定HPLC 色谱仪精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5 μL，在“1.4.2项”色谱条件下分别进样进行适应性测定。

1.5 线性关系

设定HPLC 色谱仪分别精密吸取标准对照品溶液 2.5 μL、5 μL、10 μL 和混合标准对照品溶液各 1.25 μL、2.5 μL、5 μL、10 μL、12.5 μL 进样，按步骤“1.4.2 项”的色谱条件测定峰面积，以对照品进样量（μg）为 X 轴，峰面积值为 Y 轴，绘制标准曲线，并得到线性回归方程和线性范围。

1.6 精密度实验

设定HPLC 色谱仪，分别精密吸取混合标准对照品溶液5 μL，连续进样7 次，记录分析色谱图并计算混合标准对照品溶液中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苦苷含量的RSD 值。

1.7 重复性实验

称取秦艽 5 g，威灵仙 5 g，共10 g，设置为7 组平行，按“1.4.3 项”方法制备 7 份平行秦艽-威灵仙药对水煎液的供试品溶液，设定HPLC 色谱仪分别精密吸取5 μL 供试品溶液进样检验，在“1.4.2 项”色谱条件下分析药对水煎液中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苦苷含量的RSD 值。

1.8 稳定性实验

取同一份秦艽-威灵仙药对水煎液供试品溶液，设定HPLC 色谱仪精密吸取5 μL 供试品溶液，在“1.4.2 项”色谱条件下进样测定 0 h～24 h 内每隔2 h 的獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的峰面积，并计算RSD 值。

1.9 加样回收率实验

量取已知成分含量的秦艽-威灵仙药对水煎液供试品溶液6 份，分别加入一定量的獐芽菜苦苷对照品、龙胆苦苷对照品和獐牙菜苷标准对照品，在“1.4.2 项”色谱条件下分别进样 5 μL，记录色谱峰，计算加样回收率。

1.10 样品含量测量

取秦艽和威灵仙饮片按“1.4.3 项”方法平行制备5 份供试品溶液，在“1.4.2 项”色谱条件下进样5 μL，测量獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的峰面积并代入“1.5 项”中的线性回归方程以计算獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的含量。

2 结 果

2.1 药对活性成分筛选与收集结果

以关键词“秦艽”和“威灵仙”于TCMSP 数据库检索活性成分，共检索到：秦艽27 个成分，威灵仙57 个成分。根据步骤2.1 中标准筛选后，秦艽-威灵仙药对共筛得13 个活性成分，其中属于秦艽的活性成分6 个，属于威灵仙的活性成分7 个，共有活性成分2 个，分别是齐墩果酸和β-谷甾醇（表1）。通过Cytoscape 构建网络拓扑图（图 1），筛选得到药对中的环烯醚萜苷类成分有獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷。

表1 秦艽-威灵仙药对活性成分及相关参数

图1 秦艽-威灵仙药对“中药-活性成分”拓扑图

2.2 适应性实验结果

以“1.4.4 项”方法进样检测的HPLC 色谱图见图2，结果可见獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的保留时间分别为 25.6 min、30.5 min 和 34.6 min，峰分离度良好。

2.3 线性关系结果

将“1.5 项”方法检测所得数据绘制标准曲线，以对照品进样量（μg）为X 轴，峰面积值为Y 轴，最终得到线性回归方程。獐牙菜苦苷的线性回归方程为 Y=507X+5.531 8（R2=0.998 2）；龙胆苦苷的线性回归方程为Y=713.23X+12.219（R2=0.998 9）；獐牙菜苷的线性回归方程为Y=296.12X+8.881 6（R2=0.997）。分析结果发现：獐牙菜苦苷在0.021 0～1.056 0 μ g，龙胆苦苷在 0.036 5～11.720 0 μg 以及獐牙菜苷在 0.016 2～1.142 0 μg 范围内线性关系良好。

图2 高效液相色谱图

2.4 精密度结果

以“1.6 项”方法分析色谱图并计算混合对照品溶液中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分别为0.42%、0.24%和1.79%，表明实验精密度良好。

2.5 重复性结果

以“1.7 项”方法检测分析秦艽-威灵仙药对水煎液中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分别为1.21%、0.07%和0.49%，表明实验具有较好重复性。

2.6 稳定性结果

以“1.8 项”方法，每隔 2 h 检测 1 次，24 h 内秦艽-威灵仙药对水煎液中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分别2.32%、0.33%和1.89%，表明样品在24 h 内具有良好稳定性。

2.7 加样回收率结果

以“1.9 项”方法检测并计算秦艽-威灵仙药对水煎液的加样回收率，獐牙菜苦苷的平均加样回收率为 99.64%（表2）、龙胆苦苷的平均加样回收率为100.20%（表3）以及獐牙菜苷的平均加样回收率为 101.11%（表4）。

2.8 样品含量测量结果

表2 獐牙菜苦苷加样回收结果

表3 龙胆苦苷加样回收结果

表4 獐牙菜苷加样回收结果

以“1.10 项”方法检测并将峰面积代入线性回归方程计算秦艽-威灵仙药对水煎液中獐芽菜苦苷、龙胆苦苷峰和獐牙菜苷的含量分别为2.13 mg/g、28.36 mg/g 和 4.51 mg/g。

3 讨 论

獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷既是环烯醚萜苷中的裂环环烯醚萜苷类成分，也是秦艽-威灵仙药对发挥药效的物质基础之一［7-8］。近年来，网络药理学的发展方兴未艾，但是由于其所得结果多数基于数据库查询和软件分析并且只能定性不能定量［9］，其结果也备受争议。本研究借助HPLC法对通过网络药理学方法检索得到的秦艽-威灵仙药对水煎液中含有的环烯醚萜苷类成分结果进行定性检测并确定了其含量，验证了网络药理学在预测秦艽-威灵仙药对水煎液成分方面的可行性，进而推广到预测其他中药的活性成分，为网络药理学提供实验数据支撑。

本研究使用紫外全波长扫描（190 nm～400 nm），查阅文献发现：獐芽菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的最大吸收波长分别为235 nm、270 nm和247 nm，因吸收波长在245 nm 处獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷色谱峰的灵敏度较高且杂质干扰较少，故选择245 nm 作为本研究的检测波长。通过查阅文献并结合不同溶剂流动相考察的实验发现，较乙腈-磷酸水溶液来说，甲醇-磷酸水溶液作为流动相有助于各峰之间的完全分离，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的分离效果较好，色谱图基线较平稳。因为本研究辅助课题组药效学研究，故选择了与药效研究相同的水煎液制备方法，以期其结果对药效学实验具有指导作用［10］。

最终实验结果表明，秦艽-威灵仙水煎液中含有獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷这3 种环烯醚萜苷类成分，与网络药理学预测结果一致，其含量按顺序排列为：龙胆苦苷（28.36 mg/g）＞獐牙菜苷（4.51 mg/g）＞獐牙菜苦苷（2.13 mg/g）。本研究从基础的仪器分析方法入手，以秦艽-威灵仙药对为例，考察了网络药理学中有效成分查询方法的可靠性，弥补了网络药理学预测成分只能定性不能定量的缺陷，为日后基于网络药理学研究中药药性理论或是作用机制提供了新的思路。