FMNL2 在胃癌组织中的表达及其临床意义

张灿灿,谭志军

（1.天津医科大学一中心临床学院，天津300192；2.天津市第一中心医院普外科，天津300192）

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，患病率和死亡率均位于世界前列，由于胃癌的复发和转移率较高，5年生存率较低，预后较差，而我国在全球范围内又属于胃癌高发国家，严重影响患者健康，是肿瘤预防和治疗的重点［1-2］。形成素样蛋白2（Formin-like 2，FMNL2）是形成素样蛋白（Formins）家族成员之一，定位于人类染色体2q23.3，调控细胞分裂、极性、黏附和形态发生［3］。FMNL2 在肌动蛋白丝成核或伸长过程中起着关键作用，影响细胞形态，同时FMNL2与癌症的侵袭和转移有密切关系［4-5］。最近几年FMNL2 作为肿瘤研究的热点，主要集中在结直肠癌［6］、黑色素瘤［7］、乳腺癌［8］等。例如，FMNL2 在结肠癌中高表达，增强结肠癌的生长和转移，并且FMNL2 表达异常的患者5年生存率较低［5-6］。但是目前FMNL2 在胃癌中的作用尚不清楚，同时胃癌晚期患者易发生转移，手术及化疗效果不佳，研究FMNL2 在胃癌中的作用机制，在胃癌的治疗上将具有重要的指导意义。本研究主要采用免疫组化和实时定量PCR 的方法检测FMNL2 在胃癌组织中的表达情况，并分析FMNL2 的表达量与其临床病理因素和生存预后之间的关系，探讨FMNL2 在肿瘤形成及转移过程中的机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集我院普外科2017年11月至2018年11月的30例患者胃癌组织标本（取自手术切除经病理检查确认为胃癌标本的组织）及对应的远癌组织（取自距离原发病灶边缘5 cm 以外且病理报告无癌残留区的组织）；男性21例，女性9例，平均年龄（63.8±11.2）岁，术前均未接受放化疗。将收集的组织标本分别存储于液氮罐和4%组织固定液中以待后续实验。本实验经过医院伦理委员会讨论通过，患者均签署知情同意书。

1.2 主要实验试剂 FMNL2 抗体购自英国Abcam公司（货号：ab72105）。免疫组化试剂盒（货号：ZLI9018）、DAB 显色液（货号：SP9001）等购自北京中杉金桥公司。动物组织总RNA 提取试剂盒购自北京天根公司（货号：DP431），引物由上海生工公司合成。逆转录试剂盒购自美国Promega 公司（货号：A5001）。SYBRGREEN购自瑞士Roche公司（货号：4913914001）。

1.3 免疫组化 按照免疫组化步骤进行实验，经预实验得出FMNL2 一抗的最佳稀释浓度为1：200，以PBS 作为阴性对照。免疫组化评分(IHC 评分)通过其染色强度及阳性细胞率进行评分，染色强度分为4类：0（阴性）、1（弱染色）、2（中等染色）、3（强染色）；阳性率（即阳性细胞占所有细胞百分比）分为5类：0（＜1%）、1（1%～25%）、2（25%～50%）、3（50%～75%）、4（＞75%）。IHC 评分为各个染色强度与其对应的阳性细胞率乘积之和，双盲法阅片，本研究中IHC 评分标准如下：胃癌中FMNL2 低表达IHC评分为≤7，高表达IHC 评分为≥8。

1.4 组织总RNA 提取及逆转录 取约20 mg 组织，加入300 μL 裂解液匀浆，完成后加入590 μL 无酶水和10 μL 蛋白酶K，混匀后56 ℃金属浴20 min，低温离心机以12000×g 离心5 min，取上清420 μL和等量无水乙醇轻柔混匀置于吸附柱中离心1 min，加入350 μL 去蛋白液离心1 min，加入80 μL DNase I 工作液，室温静置15 min，重复一次去蛋白液，加入500 μL 漂洗液室温静置2 min 离心1 min，重复一次后加入DEPC 水溶解离心即可得RNA 液。按照逆转录试剂盒说明操作制备cDNA：取1 μg RNA 和1 μL Oligo（dT）后，补DEPC 水至10.5 μL，70 ℃反应5 min 后迅速置于冰上，加入4 μL 5×Reaction Buffer、3 μL MgCl2、1 μL PCR Nucleotide Mix、1 μL Reverse Transcriptase 和0.5 μL RNnasin®Ribonuclease Inhibitor，程序设为：25 ℃5 min、42 ℃60 min、70℃15min，反应完成后所得反应液为cDNA。

1.5 实时定量PCR 法测定胃癌组织中FMNL2 的表达情况 FMNL2 的上游引物为5′-CCCGCTCTGGAAGACATT-3′，下游引物为5′-CTGCCAACAG TAAGACAAG-3′；GAPDH 的上游引物为5′-TGCAC CACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物为5′-GGCATG GACTGTGGTCATGAG-3′。建立20μL 反应体系［Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL］，设置反应条件：预变性95 ℃10 min；95℃10 s，60 ℃30 s，40 个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。通过循环数法2-△△ct计算位于组织中各指标的表达情况。

1.6 通过Kaplan-Meier数据库分析FMNL2基因mRNA水平与胃癌患者生存预后的关系 Kaplan-Meier 数据库是一个包含5 种癌症（乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和肝癌）的mRNA 表达谱芯片公共数据库，从中能够获得基因表达与疾病预后的信息。通过此数据库输入胃癌与目的基因FMNL2 来挖掘数据，即可得到该基因表达的K-M 曲线图。

1.7 统计学处理 通过软件SPSS19.0 对实验数据进行分析，计数资料采用卡方检验，计量资料以±s表示，两两比较采用组间t 检验，多组间比较采用方差分析，P ＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中FMNL2 的表达情况 免疫组化染色结果如图1 所示，胃癌组织中细胞质内有大量深棕色颗粒，而在远癌组织中未观察到FMNL2 阳性细胞，说明FMNL2 在胃癌组织中的表达与其对应的远癌组织相比明显升高。

图1 IHC 检测胃癌组织中FMNL1 的表达情况(免疫组化)Fig 1 Expression of FMNL1 in gastric cancer tissues detected by IHC(IHC)

通过实时定量PCR 检测30 对胃癌组织及与其相对应的远癌组织中FMNL2 基因的mRNA 表达情况。结果如图2 所示，在胃癌组织中，FMNL2 基因的表达水平显著高于其对应的远癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 FMNL2 的表达水平与临床病理因素的关系 按照IHC 评分标准进行评分，将30例胃癌组织分为低表达组和高表达组。两组胃癌组织中FMNL2 表达与临床病理因素分析如表1 所示，FMNL2 表达与患者年龄、性别及癌症的浸润深度、肿瘤分化程度和远处转移等临床病理学特征没有显著相关性（均P＞0.05）。然而，FMNL2 表达水平与胃癌的淋巴结转移和TNM 分期之间具有相关性（均P＜0.05）。

图2 实时定量PCR 法检测胃癌组织中FMNL2 的表达Fig2 Expression of FMNL2 in gastric cancer tissues detected by real-time PCR

2.3 胃癌患者FMNL2 基因mRNA 水平与生存预后之间的关系 通过Kaplan-Meier 数据库分析了胃癌组织中FMNL2 基因的表达水平和胃癌患者生存预后之间的关系。结果如图3 所示，胃癌组织中FMNL2 基因高表达（high）患者组的生存期较短，生存预后较差，其中位生存期为29 个月，然而FMNL2基因低表达（low）患者组的中位生存期为89 个月，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

3 讨论

Formins 家族是一类参与细胞黏附、细胞分裂、细胞极性和细胞形态发生的肌动蛋白修饰蛋白，其中FMNL2 在迁移细胞的前缘产生突出的肌动蛋白结构，即板层和丝状足［9-10］。FMNL2 可促进上皮间质转化［5］，这与细胞黏连的丧失和迁移能力的增强有关［11］。在健康组织中，FMNL2 广泛表达，最高表达在中枢神经系统［10，12］；FMNL2 在几种癌症中表达上调，尤其是在转移性肿瘤中［6，13］。不受控制的增殖以及侵袭性和转移性是恶性肿瘤的一个特征。因此，对肿瘤组织中FMNL2 的研究是必要的。

迁移和侵袭是肿瘤转移的重要起始步骤。而FMNL2 与肿瘤的迁移和侵袭密切相关，例如，FMNL2在结肠癌中的表达与肿瘤侵袭和淋巴转移密切相关［14］。Zhu 等［6］研究表明，FMNL2 在结肠癌中的表达水平较高，同时FMNL2 的高表达也被发现与结肠癌的侵袭和迁移相关［14］，这为FMNL2 在癌细胞生长中的作用提供了直接证据。相反，在FMNL2 水平较低的肝癌中，FMNL2 过表达抑制肝癌细胞的运动和侵袭［15］。这说明FMNL2 在不同肿瘤类型中起着不同的作用。在胃癌细胞中发现：抑制FMNL2 基因的表达可影响胃癌细胞的增殖并诱导其凋亡，这表明FMNL2可能参与胃癌的生长［16］。本研究探讨了FMNL2 在胃癌组织中的作用，结果发现FMNL2 在胃癌组织中高表达，并且高表达组的胃癌恶性程度较高，促进淋巴结转移，表明FMNL2 可能与胃癌发展进程以及转移密切相关。此结果与Zhong 等发现的FMNL2 参与胃癌细胞转移的结论一致。然而FMNL2 在胃癌发生、发展中的作用机制还有待进一步探索。

在多种人类癌症中均发现FMNL2 的异常表达，并且与肿瘤进展和不良预后相关，例如在结直肠癌中，FMNL2 高表达可能与淋巴转移瘤相关，而在肝癌中，FMNL2 表达降低被认为是预后较差的一个标志［15，17］。通过Kaplan-Meier 数据库分析FMNL2在胃癌中对生存预后的作用，发现胃癌患者FMNL2高表达组的生存期少于低表达组的生存期，中位生存期仅29 个月。本研究结果推测，在胃癌组织中FMNL2 表达量越高，胃癌的恶性程度越高，患者的预后也越差。

综上所述，通过本实验证明FMNL2 在胃癌组织中高表达，并且FMNL2 很可能是了解胃癌发生和转移的重要生物学分子，为胃癌的治疗提供了新的思路和途径。