牛乳铁蛋白活性多肽LfcinB在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

刘珂杭,宗西翠,张慧丹,完颜杨珂,陈玉清

(1.南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏 南京 210023) (2.南京中医药大学翰林学院,医学院西医基础教研室,江苏 泰州 225300)

抗菌肽是广泛存在于生物界的先天免疫小肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能[1-3]. Bovine lactoferricin(LfcinB)是一种阳离子抗菌肽,它是牛乳中的乳铁蛋白在酸性条件下经胃蛋白酶水解后,从N端释放的由25个氨基酸残基组成的生物活性多肽[4]. LfcinB的氨基酸序列为FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF,结构中的2个半胱氨酸通过形成分子内二硫键使LfcinB呈现不完全的桶状结构. 研究发现二硫键在LfcinB生物活性中的作用不大,被破坏后抗菌活性并不减弱[5].

LfcinB具有多种生物学功能. 不同细菌对LfcinB的敏感性有所不同;LfcinB浓度在0.1 μg/mL时,对敏感细菌的生长就有明显的抑制作用[4]. LfcinB和某些抗生素之间存在协同作用,盐酸二甲胺四环素和LfcinB联合使用能够显著提高对抗生素敏感的耐药金黄色葡萄球菌的抑菌作用[6]. 另外,Yan等发现LfcinB对人类关节软骨和滑膜产生有效的抗分解代谢和抗炎作用[7]. Mader等研究发现LfcinB对人类白血病细胞有细胞毒性,但对正常人类淋巴细胞、成纤维细胞或内皮细胞没有任何不良影响,LfcinB可以通过诱导活性氧的产生诱导线粒体依赖的凋亡途径杀死癌细胞[8].

抗菌肽分子量小、分子中含有碱性氨基酸使得对一些蛋白酶敏感,并且也存在表达产物对宿主细胞的潜在毒性. 因此,为避免抗菌肽对宿主细胞的潜在毒性,降低蛋白酶的水解作用以及方便纯化和制备,通常采用大肠杆菌融合表达系统[9]. 目前已报道多种可成功用于抗菌肽的原核表达和纯化的融合标签,包括GST、MBP、DAMP21、Trx等[10]. 泛素化相关小分子蛋白(SUMO)标签是一种已被用于大肠杆菌融合表达系统,与SUMO融合可以增强目的蛋白的可溶性表达,切割SUMO标签的SUMO蛋白酶也具有高度的特异性和高效的切割效率,并且当目标蛋白直接融合到SUMO的C端时,SUMO蛋白酶裂解后不会在目标蛋白的N端留下多余的氨基酸残基[11]. 鉴于SUMO标签的促进融合蛋白的可溶性表达、保护融合的蛋白免受蛋白酶水解的作用、标签容易切除的优点,近年来广泛应用于多种蛋白质的融合表达. 抗菌肽分子量小,融合表达时通常产量很低,多基因串联表达被认为是提高小分子肽表达产量的有效方法[12]. 因此,本研究首次尝试以SUMO作为LfcinB融合标签,采取LfcinB基因串联表达的策略,以期获得较高得率且有生物学活性的LfcinB,为发展更有效的重组抗菌肽制备技术提供实验依据.

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与试剂

大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)、DH5α和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)购自中国菌种保藏中心;大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12由本实验室保藏. 表达载体pSUMO为本实验室保存;HindⅢ、XbaⅠ、BamHⅠ、BglⅡ以及Taq酶和DNA Marker、蛋白质Marker、T4 DNA Ligase均购自TaKaRa生物公司;DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒购自诺唯赞公司;Ni2+chelating Sepharose Fast Flow购自Pharmacia Biotech公司;鼠抗anti-6×His一抗,山羊抗鼠IgG(FITC)购自日本Wako公司;IPTG购自Promega公司. Annexin V-FITC/PI购自南京凯基生物公司.

1.2 方法

1.2.1 表达载体pSUMO-(LfcinB)n的构建

根据抗菌肽LfcinB的核苷酸序列和载体pSUMO多克隆位点,设计合成pSUMO-F和pSUMO-R两条引物. 两引物中除了引入克隆位点(BamHⅠ和Hind Ⅲ)以外还引入了BamHⅠ的同尾酶BglⅡ以及羟氨的识别序列等位点. 引物序列如下(红色字体表示BamHⅠ酶切位点,蓝色字体表示Hind Ⅲ酶切位点,黄色字体表示BglⅡ酶切位点,划线部分为羟胺切割位点):

pSUMO-F:5′ CGGGATCCAACGGCTTTAAATGCCGCCGCTGGCAGTGGC 3′,

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pSUMO-R:5′ CCAAGCTTAGATCTGCCGTTGCCACTGCCAGCGGCGGCATTTAAA 3′.

以实验室构建的载体pET32a-LfcinB为模板合成含有LfcinB的核苷酸序列,BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切pSUMO质粒和LfcinB基因的PCR产物,经T4 DNA ligase连接后转化至E.coliDH5α. 转化液涂布到氨苄抗性的LB平板上,37 ℃倒置培养,待长出单菌落. 提取单菌落中的质粒进行测序,获得正确的重组质粒pSUMO-LfcinB.

1.2.2 表达载体pSUMO-(LfcinB)2和表达载体pSUMO-(LfcinB)3的构建

用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ分别双酶切质粒pSUMO-LfcinB,纯化后回收酶切片段,16 ℃下用 T4 DNA Ligase连接上述双酶切的载体和片段,连接液转化至E.coliDH5α,涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上,37 ℃,12 h～16 h进行倒置培养待其长出单菌落. 提取单菌落的质粒,获得pSUMO-(LfcinB)2并测序鉴定. 进一步将得到的pSUMO-(LfcinB)2用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ分别双酶切,回收双酶切产物后经T4 DNA Ligase连接过夜,转化至E.coliDH5α. 涂布固体LB平板上(50 μg/mL 卡那霉素)于37 ℃倒置培养12 h～16 h,挑选阳性克隆提取质粒,获得pSUMO-(LfcinB)3,测序鉴定.

1.2.3 表达宿主菌的构建

将以上序列鉴定正确的pSUMO-LfcinB、pSUMO-(LfcinB)2、pSUMO-(LfcinB)3质粒分别转化至宿主菌E.coliBL21(DE3),涂布固体LB平板上(50 μg/mL卡那霉素),于37 ℃倒置培养12 h～16 h,挑选单个克隆培养,提取质粒进行测序鉴定,获得重组表达菌E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)1、E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)2和E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)3.

1.2.4 SUMO-(LfcinB)n重组蛋白的诱导表达与纯化

重组蛋白质量的计算方法:使用考马斯亮蓝试剂盒测定各个拷贝菌株中上清蛋白的浓度,并利用Bandscan 5.0软件对凝胶图片中的电泳条带进行光密度分析,计算重组蛋白质量.

1.2.5 LfcinB的纯化

每50 μg SUMO-(LfcinB)n融合蛋白加入1 U SUMO酶,30 ℃反应30 min. 再用1M羟氨切割2 h,切割产物用PBS缓冲液透析去除羟氨,再通过Ni2+-IDA-Sepharose CL-6B层析分离纯化,收集穿透峰对应流出液,用PBS缓冲液进行透析. 最后将样品上样于半制备分离柱Bechman C18,在 Agilent HPLC 1100层析仪上进行反相分离,用含0.1%的三氟乙酸的15%～75%乙腈进行梯度洗脱,收集洗脱峰样品,透析后冷冻干燥保存. 保存的冻干样品取少量溶解测浓度,并计算回收率.

重组蛋白纯化回收率(%)=回收重组蛋白的质量/切割融合蛋白质量×100%.

1.2.6 Tricine-SDS-PAGE电泳

冻干样品溶于无菌水后考马斯亮蓝试剂盒测定浓度,然后取样品进行Tricine-SDS-PAGE,浓缩胶浓度 4%,夹层胶浓度 10%,分离胶浓度16.5%,按常规方法进行.

1.2.7 抗细菌活性的测定

采用琼脂糖孔穴扩散法测定重组LfcinB对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗菌活性. 对数生长期细菌按1%加入琼脂糖 LB 培养,凝固后用灭菌枪头打孔,在孔中加入待测样品液,于37 ℃ 倒置培养过夜,观察抑菌活性.

1.2.8 抗肿瘤毒性检测

1×106/mL鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞1 mL培养于6孔板,分别用不同浓度重组LfcinB肽孵育16 h;收集细胞加入凋亡检测染色液 Annexin V-FITC和PI,室温避光反应15 min,分别进行荧光显微镜观察和流式细胞仪检测,激发波长Ex=488 nm;发射波长Em=530 nm.

1.2.9 统计分析

使用Origin 8软件进行统计,获得至少3次独立实验的所有数据并表示为(平均值±标准偏差)(S.D.). 使用单因素方差分析(ANOVA)分析数据以确定不同组之间的显著差异.P<0.05被认为具有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 pSUMO-(LfcinB)n表达质粒的构建

为提高抗菌肽的表达产量,通常采用串联多聚体形式来代替单体形式进行抗菌肽的融合表达[9,13]. pSUMO是本实验室前期构建的一个带有SUMO标签的原核表达质粒,具有BamHⅠ、XbaⅠ、BglⅡ等多克隆酶切位点. 将扩增得到的LfcinB基因片段和pSUMO经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连接获得pSUMO-LfcinB. 将得到的质粒pSUMO-LfcinB利用同尾酶技术,对pSUMO-LfcinB分别用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ两个双酶切体系进行切割,然后对两个体系分别回收大、小片段,用T4 DNA Ligase连接大小片段后即可得到双拷贝表达载体pSUMO-(LfcinB)2. 用同尾酶技术进一步对pSUMO-(LfcinB)2进行切割和连接,得到3个串联拷贝数的重组质粒pSUMO-(LfcinB)3. 构建的大体流程如图1所示. 同尾酶是指具切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶,利用同尾酶技术可以构建多拷贝串联基因重组质粒[14]. 本研究中利用同尾酶BamHⅠ和BglⅡ酶切连接后形成新序列GGATCT,并结合非同尾酶XhoⅠ使得LfcinB基因片段能够定向连续插入载体,成功构建出pSUMO-(LfcinB)n(n=2,3),经测定序列构建正确.

2.2 SUMO-(LfcinB)n重组蛋白的表达

pSUMO-(LfcinB)n转化至宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)细胞,得到重组菌株E.coliBL21/pSUMO-(LfcinB)n(n=1,2,3). 重组菌株加入IPTG诱导不同时间,测定SUMO-(LfcinB)n表达产物对宿主细胞的毒性,结果如图2a所示. 各重组菌株的生长速度比较如下:E.coli/pSUMO-(LfcinB)3

由于抗菌肽自身的抗菌性,通常采用融合表达策略以降低潜在的宿主细胞毒性. 然而,并非所有的融合标签都能有效避免宿主细胞毒性,例如GST标签并不能有效避免宿主细胞毒性[15]. 本研究发现SUMO标签融合能在一定程度上避免(LfcinB)n宿主细胞毒性,并且影响的程度与串联拷贝数有关. SUMO-(LfcinB)3表达的宿主细胞毒性最大,SUMO-(LfcinB)2表达的宿主毒性最低,推测原因可能在于不同拷贝数串联(LfcinB)n与SUMO在空间上的相互影响不同,SUMO能较好屏蔽(LfcinB)2,因此仅产生较弱的宿主细胞毒性. SUMO标签已广泛用于抗菌肽的E.coli表达而避免了宿主细胞毒性,例如Cecropin A-LL37和Plectasin等抗菌肽[16-17]. 有研究认为,SUMO标签能通过周围亲水和中心疏水核心结构显著提高融合抗菌肽的可溶性表达[18]. SUMO标签能有效帮助蛋白质折叠,显著提高包括抗菌肽在内的多种蛋白的可溶性表达[19-20]. 本研究也发现,即使是2个LfcinB的串联抗菌肽,SUMO标签也能实现90%的可溶性表达.

2.3 SUMO-(LfcinB)n和LfcinB的蛋白纯化

E.coli/pSUMO-(LfcinB)n经IPTG诱导表达重组蛋白,将超声波破碎细胞的细胞上清液进行Ni2+-NTA亲和层析,收集蛋白质峰对应样品,SDS-PAGE电泳分析如图3所示. 在SUMO-(LfcinB)n对应分子量处均有一条明显而单一的条带. 因为SUMO的N端有6×His-tag,经His抗体的Western blotting分析进一步证实纯化产物为SUMO-(LfcinB)n融合蛋白. 在1 L的培养体系中,纯化得到的SUMO-LfcinB、SUMO-(LfcinB)2和SUMO-(LfcinB)3的产量分别为69.1 mg、150 mg和57 mg. 用SUMO标签融合表达设计时通常在SUMO的N端添加(His)6-tag,以便于亲和纯化和检测[21-22]. 本研究用(His)6-tag高效纯化出SUMO-(LfcinB)n,以用于后续进一步的切割与纯化. 尽管多聚体串联表达时随着肽与载体的质量比的增加,可能提高肽的产量和稳定性. 本研究却发现,2个LfcinB串联表达得到的产量高于单拷贝LfcinB和3拷贝 LfcinB 串联表达的产量,可见SUMO融合蛋白的表达量与串联拷贝数间并无线性正相关. 有报道通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将蟹MT基因的2个和3个拷贝的串联重复序列整合在一起,采用SUMO融合表达系统在大肠杆菌中表达,增加了重组MT蛋白的稳定性和溶解性,并且显著增强了Cu,Cd或Zn的耐受性和生物积累[23]. 因此,串联表达是提高产量的有效方式. 然而,对于不同的分子,串联数并非越多越好,最佳串联数取决于融合标签和串联肽的相互影响.

经亲和层析纯化得到的SUMO-(LfcinB)n融合蛋白用SUMO酶在30 ℃酶切30 min,以释放抗菌肽(LfcinB)n. Tricine-SDS-PAGE测定SUMO酶的酶切作用,结果如图4所示. 可见SUMO酶能高效切割 SUMO-(LfcinB)n融合蛋白,释放(LfcinB)n. 将SUMO-(LfcinB)2的SUMO酶切反应体系用Ni2+-NTA进行第二次亲和纯化,收集不能被Ni2+-NTA吸附的穿透峰样品,再用羟氨切割释放LfcinB,透析处理去除羟胺等小分子成分得到纯化的样品,经电泳检测为分子量约3.4 kDa的重组LfcinB,且在1 L的培养基中能得到约15 mg的重组LfcinB. SUMO酶是一种识别SUMO空间结构并切除SUMO的特异性酶,无需添加任何酶切位点,因此切割产物中无额外的氨基酸序列[24]. SUMO酶独特的切割方式对表达小分子多肽非常有利,因为额外的氨基酸序列对小肽的功能影响可能比大分子蛋白更为显著. 大量的研究显示,SUMO酶切割释放的抗菌肽具有很好的生物学活性[9],进一步显示SUMO融合表达系统在抗菌肽基因工程领域的优势.

2.4 检测重组LfcinB的抗菌活性

已有研究表明,天然LfcinB对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有抗菌作用[4]. 本研究对纯化得到的重组LfcinB进行抗Staphylococcusaureus活性鉴定,结果如图5 所示. 琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示,15 μmol/L 的重组LfcinB处理观察到抑菌圈,25 μmol/L重组LfcinB处理的抑菌圈更为明显,表明重组LfcinB具有对Staphylococcusaureus的抗菌活性. 已有多个研究报道,SUMO标签可溶性表达获得的重组抗菌肽具有较好的抗菌活性[22,25]. 本研究采用SUMO融合2个拷贝的LfcinB串联表达,经SUMO酶和羟胺切割后得到了具有抗菌活性的重组LfcinB,表明SUMO融合与串联表达相结合的策略,可以得到具有生物学活性的重组抗菌肽.

2.5 重组LfcinB对肿瘤细胞PC12作用的分析

天然LfcinB对多种恶性肿瘤细胞具有抗癌活性[26]. 本研究选用大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞,评价重组LfcinB对PC12细胞的杀伤活性. 不同浓度的重组 LfcinB 对肿瘤细胞PC12 处理12 h后分别进行形态学观察和流式细胞分析,结果如图6所示. PBS对照组的PC12细胞形态完好,25 μmol/L重组LfcinB处理12 h的PC12细胞形态模糊;而当浓度提高到50 μmol/L,PC12发生碎片化,表明大部分细胞死亡. Annexin V/PI染色结合流式细胞术进一步揭示重组 LfcinB 对肿瘤细胞PC12的杀伤作用. 25 μmol/L重组LfcinB诱导11.77 %的PC12细胞凋亡,50 μmol/L的重组LfcinB可以诱导27.68 %的PC12细胞凋亡和23.67 %的PC12细胞坏死. 可见重组LfcinB对PC12细胞具有杀伤活性,能够诱导PC12细胞凋亡,高浓度的重组LfcinB还可以诱导PC12细胞坏死. 近年来越来越多的研究揭示LfcinB可以通过多种机制发挥对多种恶性肿瘤细胞的抗癌作用,LfcinB可以靶向V-H+-ATPase选择性地杀伤高转移性乳腺癌细胞和高转移性前列腺癌细胞[27-28];LfcinB可以通过提高抑癌基因的表达、诱导凋亡、抑制血管生成等多种途径发挥对结直肠癌的选择性抗癌作用[29]. LfcinB对多种恶性肿瘤的选择性杀伤作用显示出其在抗癌领域的潜在应用价值. 本研究利用大肠杆菌表达系统获得具有抗癌活性的重组LfcinB,将推动LfcinB在抗癌领域的应用.

3 结论

本研究首次将SUMO标签融合和串联表达相结合,利用同尾酶技术成功构建出重组质粒pSUMO-(LfcinB)n(n=1,2,3). 通过在LfcinB串联序列间设计羟氨切割位点,利用SUMO酶和羟氨成功从SUMO-(LfcinB)n融合蛋白释放出重组LfcinB单体. 研究认为SUMO标签能显著促进SUMO-(LfcinB)n的可溶性表达,并能在一定程度上避免(LfcinB)n的宿主细胞毒性,其中2个拷贝基因串联的宿主细胞毒性最低,产量最高. 获得的重组LfcinB对金黄色葡萄球菌表现出一定的抑菌作用,对大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞具有促凋亡和坏死效应. 2个拷贝的基因串联对采用pSUMO-(LfcinB)n系统原核表达LfcinB优于单拷贝和3拷贝串联. 多拷贝表达策略能在一定程度上提高目的蛋白的表达量,但不是绝对的,即表达量和拷贝数不成正比,其具体原因和机理有待于进一步探讨和研究. 本研究首次将SUMO融合与串连表达策略用于抗菌肽LfcinB的大肠杆菌基因工程,为生产具有抗菌和抗癌活性的抗菌肽应用于临床提供了有效的方法.