美国白蛾热激蛋白家族基因的筛选与鉴定

杨广生　张兰　张猛　陈琪

摘 要：热激蛋白（Heat shock protein，HSP）一般是指生物体遇到极端环境时大量表达的一类高度保守基因，在昆虫的抗逆性反应中发挥重要作用。以世界性入侵害虫美国白蛾（Hyphantria cunea）基因组数据为依据，对白蛾的HSP家族基因进行筛选与鉴定。结果表明：美国白蛾体内共有20个HcunHSPs，包括8个HSP20s、7个HSP40s、4个HSP70s和1个HSP90;结合美国白蛾12个转录组中上述HSPs的表达量及鳞翅目中已有相关基因的功能研究，对HcunHSPs功能进行了初步预测。研究结果可为后期对美国白蛾抵抗逆境胁迫机制研究提供分子理论基础，为针对美国白蛾的绿色防控提供基因靶标和新思路。

关键词：美国白蛾;热激蛋白;基因组;转录组

中图分类号 S763.42文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）12-0010-04

热激蛋白（HSP）又名应激蛋白或分子伴侣，广泛分布于真原核生物中，通常在细胞或生物体遇到极端环境如高温、寒冷、缺氧、UV辐射、拥挤、伤口愈合和组织重建时发挥作用[1-4]。根据HSP在生物体内的表达情况可被分为组成型HSP和诱导型HSP[5]。前者在生物体常态即大量表达，对外界胁迫不敏感，主要参与生物体的生长发育;后者常作为分子伴侣发挥作用，通常情况下不表达或低表达。在昆虫中，当虫体遇到胁迫刺激时，诱导型HSP可通过上调表达量，与异常蛋白结合帮其重新折叠，避免细胞内蛋白质损伤严重，从而起到保护昆虫免受环境刺激的影响。目前最被相关学者认可的是根据热激蛋白的分子量（kDa）大小进行分类，一般可被分为HSP90、HSP70、HSP60以及小分子热激蛋白（small heat shock protein，sHSP，蛋白质分子量低于50kDa的热激蛋白，常包括HSP20、HSP40）等4类[6]。

美国白蛾（Hyphantria cunea），又名秋幕毛虫、秋幕蛾，隶属鳞翅目（Lepidoptera）、灯蛾科（Arctiidae）、白蛾属（Hyphantria），是一种取食范围极广的世界性重要入侵害虫，其大量暴发时受害树木部分树冠被网幕覆盖，树叶全部被食光，可对森林生态系统造成毁灭性破坏。目前，美国白蛾的基因组和不同组织与龄期的转录组数据已经公布，为本次研究提供了有利基础。

笔者借助美国白蛾基因组的基因注释信息和NCBI-Blastp，对其热激蛋白家族基因进行了筛选与鉴定，并结合不同组织和龄期中热激蛋白基因的表达量变化对其功能进行初步分析。通过对美国白蛾体内热激蛋白的筛选与鉴定，为后期研究美国白蛾适应环境变化及应对极端环境的分子机制提供理论基础，为开发绿色防控基因靶标提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究材料 主要利用美国白蛾基因组和12个不同龄期和组织的转录组测序数据[7]，包括：（1）不同龄期：卵、2龄幼虫、4龄幼虫、蛹以及雌雄全虫;（2）不同组织：头、胸、腿、腹、触角和雌虫性腺。转录组数据主要利用美国白蛾热激蛋白家族基因在12个转录组样本的表达量数据FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）。

1.2 研究方法

1.2.1 美国白蛾HSP家族基因筛选 借助美国白蛾已发表的基因组注释信息[7]，以Heat shock protein和HSP作为关键词检索相关基因信息，并在基因组测序结果中将对应基因的核苷酸序列整理出来。利用在线翻译工具ExPASy（https：//web.expasy.org/translate/）将初筛得到的美国白蛾HSP家族基因核苷酸序列翻译为氨基酸。

1.2.2 美国白蛾HSP家族基因鉴定 利用NCBI中的Blast对在基因组中初筛得到的HcunHSPs家族基因的氨基酸进行在线同源比对，查看Query cover和Ident值均较高的基因序列信息，对美国白蛾HSP家族基因进行进一步鉴定。其中Query cover表示所比对序列与目标序列的覆盖度，Ident表示所比对序列与目标序列的相似度。两者均以百分比表示，百分数越大，基因之间相似度越高。

1.2.3 美國白蛾HSP家族基因功能初步预测 借助美国白蛾12个不同龄期与组织的基因表达信息FPKM值[7]，比较美国白蛾HSPs家族基因在样本中的表达情况，关联该时期或组织的功能特点，并结合国内外关于该HSP已有功能研究，对美国白蛾HSPs的功能进行初步预测。

2 结果与分析

2.1 美国白蛾HSP家族基因 在美国白蛾基因组注释信息中，共筛选到29条与HSP相关的序列信息，其中有9条为不符合筛选目的的序列，包括HSP-binding protein、分子量大小不符合以及经过NCBI-Blast后同源性极低的序列。经过滤不符合要求的信息后，共获得20个美国白蛾HcunHSP家族基因（见表1），包括：8个HSP20s、7个HSP40s、4个HSP70s和1个HSP90。此外，鉴定得到的HcunHSP70中，有3个HcunHSP70（Gene ID分别为：EVM0013579、EVM0003299、EVM0000698）均包含已报道的HSP70特有序列IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、VVLVGGSTRIP[5]。HcunHSP90（Genen ID：EVM0012516）包含了YSNKEIFLRE、LGTIAKSGT、IKLYVRRVFI、GVVDSEDLPLNISR 4条HSP90特有序列[5]。7个HcunHSP40基因均为DnaJ homolog，且均与家蚕（Bombyx mori）的BmorDnaJ （HSP40）同源性匹配度高，除了EVM0001102（与BmorDnaJ （HSP40）homolog 9比对结果覆盖度达 99%），其他6个HcunHSP40与家蚕不同的BmorDnaJ （HSP40）的NCBI-Blast比对结果中的覆盖度均达到了100%（见表1），相似度极高。研究表明HSP20保守性较差，所以8个HcunHSP20在NCBI中比对结果相对于其他HcunHSPs的同源比对结果中，覆盖度和相似度偏低，但仍具有一定的相似性。

2.2 美国白蛾HSP家族基因的表达量及功能 借助美国白蛾12个样本的转录组测序结果中美国白蛾HSP家族基因的表达量（FPKM）信息（见表2、3），结果显示相同HcunHSP在不同樣本和不同HcunHSPs在相同样本中的表达差异均很大。

在HcunHSP20s中，基因EVM0013517与EVM0003954在不同龄期中的表达趋势相似，均在雌成虫中表达量最高，但在不同组织中，两者分别在胸部组织和性腺中表达量最高。异色瓢虫中（Harmonia axyrides）的HaxyHSP21.53也是在成虫期表达量达到最高，在瓢虫生长发育中发挥重要作用[8]，因此推测HcunHSP20中的上述2个基因可能也与美国白蛾的生长发育具有重要联系，且EVM0003954主要在雌成虫性腺中表达，可能对性腺功能有重要影响，推测属于组成型HSP，或可应用于美国白蛾防治的基因靶点。现有研究一般认为HSP20主要作为昆虫应对高温胁迫时发挥响应的分子伴侣，如抑制红尾肉蝇（Sarrcophaga crassipalpis）的HSP23表达会降低其非滞育蛹的耐热性[9]。

在HcunHSP40s中，EVM0002427和EVM0010789在卵块中表达量较高，可能参与美国白蛾卵的抗性反应;EVM0001102在成虫期表达较高，且在不同组织中表达差异不大。HSP40目前被证实在昆虫遇到缺氧刺激时可参与维持细胞中蛋白质稳态，主要作为帮助蛋白质折叠的分子伴侣。也有研究发现HSP40参与家蟋蟀落翅型翅二型的分化[10]。研究筛选得到的HcunHSP40s与鳞翅目中模式昆虫家蚕的BmorHSP40s的同源性较高，推测其功能可能与其相似，可能参与美国白蛾的抗逆和抗病过程[11]。

在HcunHSP70中，EVM0013579在12个样本中均未检测到表达，推测该基因可能不表达或响应极端环境刺激才会有所表达，与草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）SfruHSP70同源性较高，而研究表明SfruHSP70参与ATP-binding（https：//www.uniprot.org/uniprot/Q8I866）;EVM0003299基因仅在美国白蛾卵块和触角中检测到表达，但表达量均比较低，该基因与斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的SlitHSP70同源性较高，研究表明SlitHSP70响应锌胁迫[12]。EVM0000698仅在美国白蛾腹部中有表达且不高，该基因也与SlitHSP70具同源性（见表1），在S. litura中，SlitHSP70在中肠中表达，但在脂肪体中表达量最高。上述3个基因是检测到3条HSP70特有序列的3个基因，是典型的HSP70。EVM0001158在不同龄期和组织中表达量差异不大，推测该基因表达于美国白蛾线粒体中，现有研究表明线粒体热激蛋白主要参ATP-binding和Nucleotide-binding。

在HcunHSP90中，EVM0012516在不同龄期和组织中均有表达，且在卵中表达量最高（FPKM=1232.52832）。HSP90被认为是真原核生物中含量丰富的蛋白之一，无论是否遇到胁迫，都是真核生物必不可少的蛋白[13]，可见HSP90功能强大且广泛，而HcunHSP90与黄野螟（Heortia vitessoides）HvitHSP90同源性最高，但HvitHSP90功能研究较少。在鳞翅目昆虫中，HSP90主要参与昆虫的生长发育、滞育和抗病过程[11]。因此，推测HcunHSP90也与美国白蛾的相应功能有关。

3 小结

热激蛋白一直是真原核生物中关注的热点基因。在昆虫中，因其在不同物种中的高度保守性，已成为分析物种进化的重要参考;因其响应环境刺激表达量快速上调，已成为环境监测工作中常用指标;因其主要参与昆虫抗逆反应，通过抑制HSP表达可降低虫体的抗逆性从而达到防治害虫的目的。美国白蛾作为一种危害性强而广的世界入侵害虫，从其HSP基因入手，将为研发绿色有效的监测和防控新手段提供基因靶标。研究筛选得到的HSP20（EVM0003954）、HSP40s（EVM0002427和EVM0010789）、HSP70（EVM0001158）、HSP90（EVM0012516），将可为后期的相关研究提供重要的分子理论研究基础。

参考文献

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[13]贾栋.莲草直胸跳甲热激蛋白基因对高温胁迫的响应及功能分析[D].晋中：山西农业大学，2014.

（责编：徐世红）