南岭山地南方红豆杉天然林与人工干扰群体的遗传变异分析

（中南林业科技大学 风景园林学院，湖南 长沙 410004）

南方红豆杉Taxus chinensisvar.mairei是红豆杉科Taxaceae 红豆杉属Taxus一个变种[1]，是红豆杉属在我国分布最广泛、资源量较大的种[2]。20世纪70年代以来，紫杉醇的发现是医药界的福音，但也给我国红豆杉天然资源带来了巨大灾难。大量南方红豆杉天然资源被砍伐，生境遭到了严重破坏，种群数量迅速减少[3]。1999年，我国政府将红豆杉列为国家Ⅰ级保护树种，但至今，红豆杉盗伐现象时有发生。目前，南方红豆杉天然群体仅在偏远山区或自然保护区有少量间断分布[4]，其遗传多样性保护也引起了众多学者的关注和重视[5-6]。

南岭山脉是我国南部地区重要的自然地理分界线，横跨湖南、江西、广东、广西四个省区，其独特的地理位置及多样复杂的环境给动植物生存繁衍提供了良好条件，是我国生物多样性中心关键地区之一[7]，也是我国裸子植物多样性中心之一[8]。南岭是我国建立自然保护区最多的地区之一，南方红豆杉在南岭地区得到了很好的保存及繁衍，其中不仅有少量间断分布的天然林群体，还保存有较多的村落古树林、风水林、保护地迁地林等人工或半人工干扰群体[8]。南岭地区丰富的红豆杉群体资源是研究群体遗传变异的良好材料，也是研究不同干扰程度对群体遗传变异影响的理想材料。植物叶绿体基因组相比较于核基因组而言，具有分子量小、结构简单、序列保守、进化速率缓慢、单亲遗传、几乎不发生重组等特点[9-10]。而叶绿体DNA 非编码区核苷酸替换速率相对较高，可以提供更多的变异位点。因此，叶绿体非编码区测序被广泛应用于物种的遗传多样性、谱系地理学和系统发育学研究[11]。本研究利用4 个叶绿体非编码区序列检测南岭山地8 个南方红豆杉群体（天然林和人工干扰群体各4 个）的遗传变异，通过天然林群体和人工干扰群体遗传多样性比较分析，揭示人类活动对植物群体遗传变异的影响，为制定南岭地区南方红豆杉遗传保护策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究样本来源于南岭地区8 个南方红豆杉群体，包括天然群体和人工干扰群体各4 个（表1），共64 个单株。4 个红豆杉天然群体分别为广东乳源自然保护区核心区、广西花坪自然保护区核心区、湖南黄桑自然保护区核心区和湖南桂东自然保护区核心区。4 个红豆杉人工干扰群体分别为广东南雄村落风水林、湖南绥宁村落风水林、湖南新宁林场人工林和湖南舜皇山种质资源苗圃。采集新鲜、无病虫害的嫩叶适量，硅胶干燥，于-20 ℃下 保存，用于DNA 提取。

表1 南方红豆杉采样群体信息Table 1 The information of sampling populations of Taxus chinensis var.mairei

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取

采用改良CTAB 法[12]提取南方红豆杉叶片

DNA。

1.2.2 PCR 扩增与测序

从植物叶绿体数据库中选取4 个非编码区cpDNA 通用引物（见表2）检测序列变异情况[13]。PCR 反应体系包含1×Multiplex PCR master 混合液、0.20 μM 的正向和反向引物混合液和10 ng DNA 模板。PCR 反应条件如下：95 ℃预变性 15 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，共35 个循环；60 ℃延伸30 min。PCR产物按照BigDye® Terminator v.3.1 测序试剂盒（Applied Biosystems）方法进行，乙醇纯化后在ABI3100 测序仪（Applied Biosystems）上机测序。

表2 4 个叶绿体非编码区片段引物信息Table 2 The primer of four chloroplast non-coding fragments (Heinze 2007)

1.3 序列比对与数据分析

使用Sequencher 4.10（http://www.genecodes.com/）组装每个位点的正向和反向核苷酸序列。采用MEGA 5.05 软件[14]进行序列比对，统计序列间碱基突变位点、简约信息位点等。利用DNAsp 6.0[15]软件计算单倍型数量(Ha)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)、平均核苷酸差异数(K)。Arlequin 3.1 软件[16]进行分子方差分析（AMOVA），计算种群间和种群内或组间与组内的遗传差异；采用PERMUT 2.0[17]软件计算总的基因多样性(Ht)、群体内遗传多样性(Hs)、基因分化系数GST和NST，并采用1 000 次置换试验进行检验。MEGA 5.05[12]软件构建系统发育树，Network 5.0[18]软件进行单倍型网络图构建。

2 结果与分析

2.1 叶绿体序列变异分析

采用4 个叶绿体非编码区片段（表2）对南方红豆杉64 个样本进行检测。4 个片段矫正合并后全长为2 608 bp，插入缺失（indel）13 bp，G+C含量约为32.9%，共发现3 个变异位点，其中简约性信息位点2 个，分别发生在1 252 bp 和2 337 bp处。所有样本共检测到4 个单倍型，将其编号为H1、H2、H3和H4（表3）。4个单倍型（H1,H2,H3,H4）在不同群体中的分布存在差异，单倍型H1 分布最广泛，在8 个群体中均有分布。其次是单倍型H2，除Gdnx 群体外，其均有分布。人工干扰群体检测到两个单倍型（H1、H2），天然群体除了单倍型H1 和H2 以外，还检测出两个特有单倍型H3(Gxhp)和H4(Hngd)（图1）。

表3 南方红豆杉4 个单倍型序列变异位点Table 3 Four haplotype sequence variants of Taxus chinensis var.mairei

2.2 种的水平的遗传变异

2.2.1 遗传多样性

利用DNAsp 6.0 软件分析8 个南方红豆杉群体遗传多样性，8 个群体之间的多态性表现不同（表4）。Gxhp 群体和Hngd 群体具有的单倍型数量最多，遗传多样性水平也最高，Gdnx 群体仅具有一个单倍型，因此遗传多样性水平最低。8 个群体总的单倍型多样性(Hd)为0.552，核苷酸多态性(Pi)为0.000 23，平均核苷酸差异数(K)为0.599。

2.2.2 遗传分化

通过PERMUT 2.0 软件分析，南方红豆杉群体的总的基因多样性(Ht)为0.562，群体内遗传样性(Hs)为0.473。基因分化系数NST(0.190)大于GST(0.158)（P＜0.01），表明南方红豆杉群体存在显著的谱系地理结构。AMOVA 分析结果（表5）表明，大部分遗传变异来源于群体内，占总遗传变异的82.55%，群体间变异占总遗传变异的12.85%，群体间遗传分化极显著（FSt= 0.175，P＜0.001）。

图1 南方红豆杉群体单倍型的分布与频率Fig.1 Haplotype distribution and frequency of Taxus chinensis var.mairei populations

表4 8 个南方红豆杉群体遗传多样性参数对比分析†Table 4 Comparison of genetic diversity of eight Taxus chinensis var.mairei populations

2.2.3 单倍型系统发育及网络图分析

基于MEGA 软件的邻接法（NJ）构建南方红豆杉4 种单倍型之间的系统发育树（图2）。结果显示，4 个单倍型主要分为两个分支，单倍型H2和H3 亲缘关系较近，聚为一个小分支，再和H1聚为一个大分支，而单倍型H4 单独为一个分支。

通过软件Network 5.0 软件构建南方红豆杉不同群体单倍型之间的中介-邻接网络图（Medianjoining,MJ）（图2），结果显示，单倍型H2 位于中心位置，分布数量最多，频率最高的是H1，而H3 和H4 是两个天然林特有单倍型，仅存在一个群体，频率较低。

2.3 天然林与人工干扰群体的遗传变异比较

为了探究南岭山地天然林和人工干扰林遗传变异特性及遗传分化，比较其遗传多样性及遗传分化程度。叶绿体非编码区测序结果显示，4 个天然群体的单倍型数量(Ha)为4，单倍型多样性(Hd)为0.603，核苷酸多样性(Pi)为0.000 27；人工干扰群体的单倍型数量(Ha)为2，单倍型多样性(Hd)为0.508，核苷酸多样性(Pi)为0.000 20，天然群体遗传多样性高于人工干扰群体（表4）。AMOVA 结果显示，天然林和人工干扰林两组群间存在明显的遗传变异（FCT=0.046＜0.05，P＜0.001）（表5）。

表5 南方红豆杉群体分子方差分析结果Table 5 Results of AMOVA in populations of Taxus chinensis var.mairei

图2 4 种单倍型系统发育树及单倍型网络图（圆圈的大小与单倍型的相对频率呈正比）Fig.2 The phylogenetic tree of four haplotypes and the network for haplotypes (Size of the circle is proportional to the relative frequency of a haplotype)

3 讨 论

3.1 南岭山地南方红豆杉群体遗传变异模式

本研究对64 个南方红豆杉的4 个叶绿体非编码区DNA 片段进行测序，共检测出4 个单倍型，单倍型H1 在所有种群中均有分布，且在大多数群体中占有数量优势。单倍型H2 在网络图中位于中心位置，说明单倍型H2 是较为古老的单倍型。而单倍型H4 仅在天然群体Hngd 中存在，且在系统发育树中单独聚为一支，这可能与Hngd 群体特殊的高海拔的地理位置有关。单倍型H3 只存在于天然群体（Gxhp）中且只有一个样本，其可能与叶绿体非编码区序列出现种内变异有关。

基于叶绿体非编码区序列获得的南方红豆杉总的遗传多样结果表明，群体总的单倍型多样性Hd=0.552，核苷酸多态性Pi=0.000 23，总的基因多样性Ht=0.562，和其他裸子植物相比，南方红豆杉遗传多样性处于中等水平，低于祁连圆柏Juniperus przewalskii[19]（Ht=0.57）和华南五针松Pinus kwangtungensis[20]（Ht=0.63），但高于青海云杉Pinus crassifolia[19]（Ht=0.27）。基因分化系数NST=0.190 大于GST=0.158（P＜0.01），说明南方红豆杉群体存在明显的谱系地理结构。AMOVA 分析结果表明，南岭地区南方红豆杉群体主要的遗传变异来自于群体内（82.55%）。FST的值为0.175＞0.15 且P值小于0.01，说明南方红豆杉群体间遗传分化程度高，这可能是由于南方红豆杉是雌雄异株，异交植物，通常种植于常绿阔叶林中，与针叶树种混种，限制了花粉的传播，不利于群体间基因交流，很大程度上增加了群体间的遗传分化。此外，南方红豆杉群体在南岭山脉地区呈片断化分布，南岭山脉地势复杂，形成了丰富的局部小气候[5]，群体间形成高山阻隔，加剧了群体间的遗传分化。

3.2 人类活动（干扰）对植物群体遗传变异的影响

南岭山地南方红豆杉天然林和人工干扰群体遗传多样性的比较结果显示，天然群体的遗传多样性（Hd=0.603，Pi=0.000 27）高于人工干扰群体（Hd=0.508，Pi=0.000 20），这与李乃伟等[5]利用ISSR 标记比较南方红豆杉野生种群和迁地保护种群的遗传多样性结果一致。而此现象在水松Glyptostrobus pensilis[21]、云杉Picea asperata[22]、水杉Metasequoia glyptostroboides[23]等树种的研究中也有发现。前人的研究结果表明，南方红豆杉濒危与遗传多样性并无显著关系，其对环境变化的适应能力较强，人为干扰与其生殖特性可能是造成濒危的主要原因[24]，因此，本研究中南方红豆杉天然群体遗传多样性高于人工干扰群体的原因可能是由于人工干扰群体位于离人群较近的地方，人为干扰程度较高，导致人工干扰群体遗传多样性低于天然群体。

3.3 南方红豆杉遗传资源保护策略

运用分子标记技术探究濒危或保护植物的遗传多样性及其遗传结构与变异规律，对该物种的有效保护具有重要意义[25]。南方红豆杉树形优美，材质优良，其含有的紫杉醇是目前临床上使用最广泛的天然抗癌药物之一，20世纪60年代初人们对红豆杉的过度砍伐，导致红豆杉群体数量急剧减少。本研究结果表明，天然群体遗传多样性较高，建议对所有现存的南方红豆杉群体就地保护，建立自然保护区，尽量减少人为干扰。对于具有独特单倍型的天然群体（Gxhp 和Hngd）应给予最高级别的保护，同时加强天然群体中幼苗的抚育管理，促进天然群体自然更新。此外，人工干扰群体也是其资源的重要组成部分，因此，也应该采取一定的保护措施，例如对当地村民进行宣传教育，立标识牌等。另一方面，由于南方红豆杉遗传分化程度高，因此在进行迁地保护时，应尽可能的保存不同种源的南方红豆杉，避免遗传多样性的丧失，同时辅以扦插和嫁接等栽培管理措施，加快红豆杉的繁殖，扩大种群数量。

4 结 论

本研究表明，南岭山地南方红豆杉群体间具有中度的遗传多样性且遗传分化程度高，其可能与有限的基因流、近亲繁殖和人为干扰等因素的综合影响有关。根据叶绿体非编码区序列变异分析结果，共发现4 个单倍型，其中存在两个私有单倍型，产生私有单倍型的原因可能是由于群体特殊的地理环境和种内变异。天然林群体的遗传多样性高于人工干扰群体但相差不大，且南方红豆杉群体间遗传分化大，说明南方红豆杉人工干扰群体资源也十分重要。本研究结果可为南方红豆杉群体遗传学以及南岭地区南方红豆杉遗传资源保护策略的制定提供科学依据。