邻氨基苯酚对水生生物毒性效应

林绍霞，龚会琴，李 俊，杨鸿波

（贵州省分析测试研究院，贵阳550014）

0 引 言

邻氨基苯酚分子中含有一个羟基和一个氨基，属两性有机化合物，表观显示Lewis 酸、碱两性，是一种重要的工业原料［1］，广泛用于毛皮染料及有机合成和染料中间体，如生产酸性媒介蓝R、硫化黄棕、荧光增白剂EBF等［2］。不仅是农药伏杀硫磷的主要原料，还可作为脂肪酸化学修饰剂用于分析脂肪酸，由邻氨基苯酚与羰基化合物合成的Schiff碱及某些金属配合物在催化行为、磁学性质和酶模拟等方面也有重要作用。邻氨基苯酚在污水处理系统中作为解偶联剂能优化活性污泥产率［3］，进入水体造成水环境污染，且具有毒性大难以生物降解的特性［4］。已有研究证明，长期使用含氨基苯酚的染发剂会对人体健康造成危害［5］，因此，欧盟、日本等对化妆品中氨基苯酚最大限量作了明确规定，我国《化妆品卫生规范》也对其制定了严格限量标准［6］。而目前针对邻氨基苯酚的报道多集中在污水净化处理［3］、化学工艺设计［7］方面，对邻氨基苯酚环境毒性效应的研究未见相关报道，进入水环境后对水生生物的抑制效应及浓度水平鲜有研究。

毒性试验通过设计一系列随化学物质浓度不断增高而设置的容器中进行化学物质致死或亚致死效应的典型分析，生物体对浓度不断增高的化学物质的反应是重要的测定终点［8］。水生生态系统中，从食物链关系考虑，大型溞以浮油植物为食，同时又是鱼类和大型无脊椎动物的饵料，是水生态系统中物质循环和能量流动的重要环节［9］。本研究以水生生态系统营养级上的3 种代表性生物：单细胞类的羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）、大型溞（Daphnia magna）和稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）为试验生物，通过研究邻氨基苯酚对3 种生物食物链水平的毒性数据，预测其环境无影响浓度（PNECs），通过浓度-效应曲线测定生物在特定环境浓度下的生物学反应［10］。旨在为制定邻氨基苯酚的水生生物基准值提供参考数据，为水环境标准制定和水环境管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 受试生物

试验所用的羊角月芽藻、大型溞和稀有鮈鲫种源均购于中科院水生生物研究所，其中羊角月牙藻和大型溞在试验条件下培养直至满足试验要求。试验生物信息见表1 所示。

表1 试验生物特征

1.1.2 试验物质

邻氨基苯酚：浅灰色粉末，纯度99%，购于阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.1.3 试验用水

试验用水为贵阳市市政居民饮用自来水，经曝气脱氯72 h以上，控制水质指标范围：pH6 ～9，水硬度以CaCO3计＜180 mg/L，水中溶解氧（DO）含量为80%～110%，大于空气中饱和氧含量的80%。

1.1.4 试验仪器

电子天平（Al204，梅特勒），pH 计（PHB-4，上海雷磁），藻类计数仪（S200、杭州迅速）、照度计（T-10A，柯尼卡美能达），高效液相色谱仪（1260，安捷伦），人工气候培养箱（RGX-250，泰斯特），溶解氧测定仪（HQ30d，哈希）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验环境条件

羊角月芽藻：按照文献［11］中制备的无机盐培养液中进行，并控制试验温度（23 ±2）℃；光/暗比14 h/10 h；光照强度4 400 ～8 800Lux［12］。

大型溞：曝气自来水中进行，并控制温度20 ℃，持续黑暗。

稀有鮈鲫：曝气自来水中进行，温度（24 ±0. 2）℃；光照12 ～16 h/d；试验水pH ＝8.0 左右；溶解氧不低于空气饱和值的60%。

1.2.2 试验方法

分别用无机盐营养液、曝气自来水制备邻氨基苯酚试验溶液，并以一定比例间距配制系列梯度试验溶液，在不同浓度溶液中引入受试生物，进行毒性暴露试验，并设置空白对照组。

羊角月芽藻试验用无机培养分别配制浓度0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 邻氨基苯酚溶液100 mL，引入藻种使藻细胞浓度达1 ×104cells/mL，于试验开始后24、48、72 h通过观察溶液中细胞数，评价羊角月芽藻在受试物溶液中的生长抑制情况，试验过程中监测试验溶液pH值及溶液中邻氨基苯酚浓度变化情况。

大型溞试验用曝气自来水制备邻氨基苯酚溶液系列浓度为1. 4、1. 7、2. 0、2. 4、2. 9、3. 5 mg/L 各100 mL，每个溶液中转入处于对数生长期的幼溞5 只，于试验开始后24、48 h观察并记录试验溞活动状况以评价大型溞受抑制效应，试验过程中监测溶液pH值、溶解氧和邻氨基苯酚浓度。

稀有鮈鲫试验用曝气自来水制备浓度为0. 80、0.96、1.15、1.38、1.66、2.00、2.40 和2.88 mg/L 溶液各3 L，每个溶液中引入10 尾鱼，分别于3、6、24、48、72 和96 h观察受试鱼的中毒症状并及时取出死鱼，每24 h统计一次受试鱼的死亡率，监测溶液pH值、溶解氧、邻氨基苯酚浓度。

1.2.3 计 算

（1）羊角月牙藻抑制浓度。羊角月牙藻生物量增长的抑制百分率

式中：Iy为试验组生物量增长的抑制百分率，%；Yc为空白对照组测定的藻单位生物量；Yt为试验组测定的在单位生物量。

藻生长率的抑制百分率

式中：Ic为试验组藻生长率的抑制百分率，%；μc为空白对照组生长率；μt为试验组生长率。

式中：μj-i为在时间点i到时间点j之间的平均生长率；Xi为在时间点i时的藻单位生物量；Xj为在时间点j时的藻单位生物量。

（2）半数效应浓度计算。试验数据用SPSS15.0进行处理，计算邻氨基苯酚对羊角月牙藻、大型溞、稀有鮈鲫半数毒性效应的浓度EC50/LC50和95%置信限。

2 结果与分析

2.1 邻氨基苯酚对羊角月牙藻的毒性效应

在仅有无机培养基存在的空白对照处理中，羊角月牙藻细胞呈对数迅速增长，而含邻氨基苯酚的溶液均对藻细胞生长具有不同的抑制作用。从表2 可见，培养72 h后，空白对照中藻细胞增长为初始时的253倍，随着溶液中邻氨基苯酚浓度的增大，藻细胞增长率锐减，当邻氨基苯酚溶液浓度达1.6 mg/L时，培养72 h后，溶液中藻细胞仅增长为初始的6 倍，表明邻氨基苯酚的存在严重抑制了藻细胞对数增长的规律。试验结果显示，当邻氨基苯酚浓度达0.8 mg/L时，72 h 对藻生长抑制率已达56.66%，经计算得邻氨基苯酚对羊角月芽藻的生长抑制率达50%时的浓度即72 h 的EC50为0.78 mg/L。

表2 不同暴露条件下羊角月芽藻生物量结果

在邻氨基苯酚作用下，羊角月牙藻细胞形态也发生变化，如表3 所示。当邻氨基苯酚浓度≥0.8 mg/L时，在暴露24 h后，可观察到藻细胞明显变小的现象，影响细胞分裂过程。

表3 不同暴露条件下藻细胞形态

2.2 邻氨基苯酚对大型溞的毒性效应

为避免试验溶液中溶解氧、pH值变化对溞的正常活动产生影响，实时监测溶液pH值，保证试验时溶液pH值始终维持在7.5 ±0.2，溶解氧浓度为9.5 mg/L以上，温度维持在（20 ±0.2）℃，以避免溞出现非毒性作用的异常死亡。

邻氨基苯酚对大型溞毒性作用如表4 所示，在暴露24 h条件下，邻氨基苯酚溶液浓度为2.0 mg/L时，溞开始表现出游泳缓慢和死亡的现象，当浓度达2.9 mg/L时，对溞的毒性效应达到半数致死；在暴露48 h条件下，邻氨基苯酚溶液浓度1.4 mg/L 时，溞即开始表现出游泳缓慢和死亡的现象。经计算得邻氨基苯酚对溞半数效应浓度24 h的EC50为2.6 mg/L，95%置信限为2. 4 ～ 2. 9 mg/L；48 h 的EC50为2. 2 mg/L，其95%置信限为2.0 ～2.4 mg/L。

表4 不同暴露条件下大型溞毒性效应

2.3 邻氨基苯酚对稀有鮈鲫的毒性效应

为避免水环境因素对稀有鮈鲫正常活动的影响，试验中各试验溶液的溶氧量控制在空气饱和溶解氧的70% ～100%之间，pH 值为8.0 ±0.2，溶液温度为（24±0.2）℃ 范围内，以准确表达邻氨基苯酚对鱼的毒性效应。表5 所观察的试验现象显示，在暴露96 h后，当邻氨基苯酚溶液浓度为0.96 mg/L时，稀有鮈鲫出现中毒现象。邻氨基苯酚浓度为2.88 mg/L 时，稀有鮈鲫暴露48 h后即表现出侧翻、频繁换气等中毒症状，暴露72 h即全部致死。

在邻氨基苯酚浓度为0.96 mg/L 时，稀有鮈鲫暴露96 h后死亡率达20%，浓度为2.40 mg/L 时，暴露72 h即全部致死，通过建立鱼死亡率与邻氨基苯酚浓度相关性，计算邻氨基苯酚对稀有鮈鲫48 h的LC50为2.52 mg/L，95% 置信限为2.13 ～ 2.97 mg/L；72 h 的LC50为1.52 mg/L，95% 置信限为1.22 ～1.89 mg/L；96h的LC50为1.16 mg/L，95%置信限为0.92 ～1.47 mg/L如图6 所示。在96 h 的试验周期内，使稀有鮈鲫全部死亡的邻氨基苯酚最低浓度，及最低可观察效应浓度（LOEC）为2.00 mg/L，全部存活的最高浓度，即无观察效应浓度（NOEC）为0.80 mg/L。

表5 不同暴露条件下鱼毒性效应

表6 不同暴露条件下稀有鮈鲫死亡率

3 讨 论

3.1 邻氨基苯酚的生物毒性效应级别

根据国家环境保护总局对化学品管理毒性分级标准［13］，邻氨基苯酚对羊角月牙藻72 h 的EC50为0.78 mg/L ＜1 mg/L，属极高毒性级别，对大型溞48 h 的EC50为2.2 mg/L，介于1 ～10 mg/L 间，属高毒级别；稀有鮈鲫96 h 的LC50为1.16 mg/L，介于1 ～10 mg/L间，亦属高度级别。从化学品风险控制的角度出发，危险化学品毒性划分应以敏感性生物限制为原则进行管控［14］，因此判定邻氨基苯酚对水生生物毒性时，应以敏感性水生生物——羊角月牙藻的毒性效应为限制标准，将邻氨基苯酚视为对水生生物具有极高毒性的一类物质进行管理。

3.2 邻氨基苯酚水生生物危害性

邻氨基苯酚水生生物毒性的研究未见报道，而对其同分异构体——对氨基苯酚的毒性研究显示，含对氨基苯酚的废水具有高的生物急性毒性，对梨形四膜虫、斑马鱼的24 h急性毒性LC50分别为19.5 和32.5mg/L［15］，说明处于食物链底端的低等级水生生物对氨基苯酚毒性更为敏感，而本研究得出单细胞藻的敏感性更高的结论，进一步验证了氨基苯酚的毒性效应规律。鱼类作为这一食物链上高级消费者，邻氨基苯酚通过鱼类以直接摄入或食物链累计的方式影响鱼的生长、发育和生存。在水生生物危害性试验中，为避免试验介质的差异导致试验生物的异常反应，需严格控制各种非生物因子的影响，如水溶液中溶解氧浓度、温度、氢离子浓度（pH值）等，以控制试验影响因素的一致性。随着邻氨基苯酚在毛皮染料、农药生产原料、污水处理中解偶联剂的应用，对水环境的危害风险逐步加大。邻氨基苯酚对水中微生物有抑制作用，受污染水的可生化性不强，致使水不能直接进行生化处理加以净化，针对水中邻氨基苯酚去除方法的研究在不断探索中［16］。

3.3 邻氨基苯酚环境风险性

虽然化学品对水生生物的环境风险取决于毒性效应和环境暴露量两方面，在暴露量无法评估的情况下，环境风险的监管还是依靠代表性生物的急性毒性试验数据为化学品风险管理提供重要参考依据。本研究结果显示，邻氨基苯酚对淡水生态系统食物链上3 个营养级别上的代表性生物均具有高的毒性，其中对单细胞羊角月牙藻的最为敏感，72 h的EC50为0.78 mg/L，已达到极高毒性级别，对稀有鮈鲫和大型溞的毒性效应都为高毒级别，因此对其风险监管应立足与极高毒性级别的管控，属环境危害高风险物质。

4 结 语

邻氨基苯酚作为重要的化工原料而广泛用于生产制备，其向环境扩散将构成严重环境生态。本研究得出，邻氨基苯酚对淡水生态系统食物链的3 个营养级别上代表性生物均具有高的毒性，其中对单细胞羊角月牙藻的最为敏感，72 h的EC50为0.78 mg/L，已达到极高毒性级别。对稀有鮈鲫和大型溞的毒性效应都为高毒级别。

邻氨基苯酚是一种致敏性物质，与人体接触会引起气管类疾病和接触性的皮肤炎，邻氨基苯酚吸入过量时，会引起对人的生命造成威胁的高铁血红蛋白血症。若邻氨基苯酚泄漏到自然环境中，对环境造成的危害将不可逆转性。因此，必须完善对邻氨基苯酚污染水体的控制措施，提高对邻氨基苯酚管控力度，尽最大可能降低邻氨基苯酚对水环境的危害程度。