藏猪FRZB 基因克隆及真核表达载体的构建

2020-07-11王志秀张红亮王统苗梁文双

中国畜牧杂志 2020年6期

王志秀，张红亮，王统苗，梁文双，张博，张浩*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.西藏自治区拉萨市农业农村局，西藏拉萨 860000；3.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

藏猪是我国独特的高原型地方猪种，其长期生活在海拔较高的青藏高原地区，能适应低氧、低压、高寒和强辐射环境，具有耐粗饲、抗逆性强的优良特性[1]。分泌型卷曲相关蛋白3（sFRP3）由FRZB基因编码，通过竞争性抑制Wnt/beta catenin 信号途径参与胚胎发育调控[2]。FRZB是Wnt 信号通路的负调控因子，过表达可以抑制前列腺癌PC-3 细胞的成瘤性和生长性，并降低金属蛋白酶的分泌和活性，具有抑癌基因的作用[3]。在对胃黏膜、大肠黏膜和肿瘤组织FRZB基因表达的检测中发现该基因具有肿瘤抑制的功能[4]。FRZB基因也可调控心脏房室膜垫发育，通过下调Wnt-9a 途径介导的β-catenin 信号发挥作用[5]。FRZB基因与骨骼的形态发生有密切关系，有研究发现FRZB基因和Wnt 受体基因的表达均与膝骨关节炎的发生有关[6]。FRZB基因的突变位点与骨关节炎和骨质疏松症发生等密切相关[7]。前期研究发现猪FRZB基因位于15 号染色体上，由6个外显子组成，已鉴定出3 个多态位点，其表达与肌肉生长呈负相关，与脂肪沉积呈正相关[8]。FRZB基因位点多态性与大白猪背膘厚呈极显著相关[9]，并对淮猪新品系的生长性能具有显著影响[10]。本研究旨在克隆藏猪FRZB基因CDS 序列，构建真核表达载体，为后期研究该基因的重要功能及其在细胞增殖、分化方面的机理奠定基础，也为构建FRZB转基因猪提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集藏猪饲养在西藏农牧学院实习牧场，6月龄时屠宰，采集新鲜肝脏组织，置于冻存管放入液氮罐中速冻，然后于-80℃冰箱保存，用于总RNA 提取。

1.2 主要试剂 TRIzol、2×PCR Mix、限制性内切酶Bgl II 和 Sal I 均购自TaKaRa 公司；DNA 纯化回收试剂盒、RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、T4 连接酶购自天根生化科技有限公司；DMEM、Opti-MEM、胰酶、DMSO、胎牛血清（FBS）均购自Gibco 公司；Lipofectamine 2000、去内毒素质粒提取试剂盒（Plasmid Mini Kit Ⅰ）购自Invitrogen 公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；pMD18-T、pIRES2-EGFP 载体及C2C12 细胞均由中国农业大学动物遗传资源实验室保存提供。

1.3 引物设计与合成根据GenBank 猪FRZB基因mRNA序列（登录号：NM_001243330），利用Primer premier 5设计引物，扩增FRZB基因的完整CDS 区序列。FRZB引物序列：F： 5'-GAAGATCTATTGTGTCCACTTCCA GGGGT-3'；R：5'-GCGTCGACGTTGCGTGCTTGCC GAGGGTTA-3'，预计扩增产物长1 067 bp，其中下划线部分分别为Bgl II 和Sal I 酶切位点。引物由华大基因科技股份有限公司合成。

1.4 RNA 提取和cDNA 合成采用TRIzol 与RNApure Tissue Kit 提取肝脏组织总RNA，用NanoDrop®ND-1000 紫外分光光度计检测浓度及纯度。利用两步反转法合成cDNA，第一步：5×gDNA Buffer 2μL，Total RNA 7 μL，RNase-Free ddH2O 1μL，42℃孵育3 min；第二步：在第一步产物中依次加入10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL，反应程序为42℃孵育15 min，95℃孵育3 min。

1.5 PCR 反应以cDNA为模板扩增藏猪FRZB基因CDS 序列。PCR 反应体系20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，cDNA（50 ng/μL）1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性15 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸65 s，35 个循环；72℃延伸5 min；4℃结束反应。取5 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶（1.5%）电泳，检测产物条带。

1.6 生物信息分析对藏猪FRZB基因进行生物信息学分析，利用ExPASy 相关在线服务器分析藏猪FRZB编码蛋白质氨基酸组成、理论分子、亲水性和等电点等；利用DNAMAN 软件对预测氨基酸序列进行同源比对；利用MEGA 6 软件构建系统进化树；利用SWISSMODEL 预测FRZB 蛋白质的三级结构。

1.7 克隆与测序将扩增目的片段回收、纯化，并TA 克隆至pMD18-T 载体上，连接体系10 μL：Solution 4 μL，pMD18-T 载体1 μL，扩增目的片段5 μL。16℃恒温过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在含有卡那霉素的LB 固体培养基上37℃培养。挑取单克隆，将其置于含卡那霉素的LB 液体培养基中继续培养，挑取阳性菌落进行扩大培养，送至生工生物工程股份有限公司进行测序。重组质粒命名为pMD18-TFRZB。

1.8 真核表达载体的构建将测序正确的菌液提取质粒，用限制性内切酶Bgl II 和Sal I 酶对重组质粒pMD18-T-FRZB和质粒pIRES2-EGFP 进行双酶切，分别回收相应片段的酶切产物。利用T4 DNA 连接酶将目的片段与pIRES2-EGFP 骨架载体进行连接，连接体系10 μL：目的片段4 μL、骨架载体4 μL、T4 连接酶1 μL、10×Buffer 1 μL。混匀后置于16℃孵育过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，经蓝白斑筛选后，挑取单个菌落接种至含卡那霉素的LB 培养基中，得到重组质粒pIRES2-EGFP-FRZB，经双酶切鉴定和PCR 验证后，将鉴定正确的质粒送至生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.9 细胞培养及转染将生长状态良好的C2C12 细胞进行传代至6 孔细胞培养板中继续培养，待细胞汇合度达70%～80% 时，将构建正确的重组质粒pIRES2-EGFPFRZB经脂质体转染到C2C12 细胞中，同时以未转染外源基因的细胞作为阴性对照。48 h 后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。

2 结果

2.1FRZB基因PCR 扩增及序列分析藏猪FRZB基因PCR 扩增特异性条带为1 067 bp（图1），与预期产物长度一致，且无非特异性扩增杂带。经测序证明与猪FRZB基因序列高度一致。

2.2FRZB基因蛋白质的生物信息学分析藏猪FRZB蛋白质含有325 个氨基酸，理论分子质量为36.16 ku，分子式为C1580H2553N455O465S25，等电点为8.81，总平均亲水性为-0.278，表现为亲水性。藏猪FRZB 蛋白三级结构预测见图2，发现含有多种二级结构单元，有明显的折叠层次，疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。

藏猪FRZB 蛋白氨基酸序列与GenBank 中狗（XP_025316201.1）、小鼠（NP_035486.1）、绵羊（XP_011987 239.1）、黄牛（NP_776484.1）、马（XP_001501445.1）和人（NP_001454.2）的同源性依次为91.13%、91.38%、94.46%、96.69%、97.23%和96.92%。由图3 可知，FRZB基因在不同的动物中具有较高的序列保守性。

2.3FRZB基因真核表达载体的构建将重组质粒pMD18-T-FRZB和载体骨架pIRES2-EGFP 双酶切，产物可见1 067 bp 和5 308 bp 的条带（图4），条带清晰明亮，与预期结果一致。

切胶回收酶切产物载体骨架pIRES2-EGFP 和FRZB的目的条带，经连接、转化，挑单克隆扩繁，对菌液PCR 扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图5 所示，目的条带清晰，其大小约为1 067 bp，与预期结果一致，表明pIRES2-EGFP-FRZB载体构建成功。用去内毒素质粒提取试剂盒提取pIRES2-EGFPFRZB真核表达载体。

重组质粒pIRES2-EGFP-FRZB的Bgl II 和Sal I 双酶切结果如图6 所示，可见一条1 067 bp 条带，与目的基因条带大小一致；另一条约为5 308 bp，与载体骨架大小一致。

2.4 细胞转染利用Lipofectamine2000 瞬时转染的方法将重组质粒pIRES2-EGFP-FRZB转染至C2C12 细胞，培育48 h 后，在荧光显微镜下观察到细胞有绿色荧光（图7），表明pIRES2-EGFP-FRZB真核表达载体构建成功且能转染C2C12 细胞。

3 讨论

Wnt/β-catenin 信号通路在调控细胞分化、增殖及凋亡中扮演重要角色，同时这一信号通路异常会伴随动物机体发育、生长和稳态的异常[11]。分泌型卷曲相关蛋白家族（sFRPs）有一个富含半胱氨酸的结构域，与卷曲受体的细胞外配体结合域高度同源，因此，sFRPs可通过隔离Wnt 配体与卷曲受体形成非功能性复合物来抑制Wnt 信号通路[3]，这在胚胎发育和肿瘤形成等方面发挥着重要功能[12]。Qin 等[13]在胃癌细胞中发现敲除FRZB基因能增加细胞的生长和迁移，同时伴随Wnt/β-catenin 信号通路被激活，将进一步促进胃癌的蔓延。马玉玲等[14]对人FRZB基因进行克隆，获得了慢病毒重组表达质粒，并研究其在肝癌细胞中的抗癌潜力，发现慢病毒表达体系对Wnt 信号通路的分子靶向药物研究具有重要意义。司维柯[15]研究猜测FRZB 可能是一种天然抗肿瘤因子。瞿颖等[16]研究发现FRZB与胃癌的分化和肠型及弥漫型的发生相关，并构建FRZB真核表达载体转染人胃癌细胞系SGC-7901 细胞，发现FRZB基因的高表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、成瘤性和侵袭能力[17]。这充分说明FRZB基因在抑制肿瘤方面具有重要的意义。

目前，猪FRZB基因的研究报道相对较少，已鉴定出猪FRZB基因有3 个多态位点，其表达分别与肌肉生长呈负相关[10]、与脂肪沉积呈正相关[8]、与背膘厚呈极显著相关性[9]。藏猪是少有的高原型猪种，生长缓慢，适应性极强，属典型的地方品种，因具有胴体瘦肉率高、肉质细嫩、适口性极好等特点，属奢侈品消费行列，市场上供不应求。本实验首次克隆藏猪FRZB基因并成功构建真核表达载体，通过对FRZB基因的生物信息学分析发现FRZB基因在不同家畜物种及进化过程中具有较高的序列保守性，提示FRZB基因潜在的分子功能应用价值很大，尤其是研究耐低氧低压、高寒强辐射的藏猪，对藏猪产业发展和高原医学的研发具有重要意义。尽管当前FRZB基因调控猪生长性能的分子机制尚不明确，但构建藏猪FRZB基因的真核表达载体能够为后期研究该基因的重要功能及其在细胞增殖、分化方面的机理奠定基础，为探索猪肌细胞分化过程中特异基因转录的调控和生产转FRZB基因猪提供理论依据，对挖掘藏猪品种资源的利用具有巨大的开发指导价值。