肝硬化患者肠道微生态与肌量减少的相关性研究*

郝莎莎，任晓静，原丽莉，姚 佳

肝硬化是一种由各种原因引起的慢性、进行性、弥漫性肝脏改变，常常伴有营养能量代谢改变，从而导致肌量减少或肌肉减少症[1, 2]。肌量减少或肌肉减少症是评估营养不良的指标，同时也是肝硬化患者预后不良的影响因素。人体肠道内存在数量庞大、结构复杂的菌群，彼此之间相互作用，相互制约，处于动态平衡状态，直接参与人体的消化、营养吸收和能量供应等诸多方面[6]。前期我们在研究中发现肝硬化患者易发生小肠细菌过度生长，并且与患者的营养不良密切相关[7]。研究表明相对于健康人群，肝硬化患者的肠道菌群结构发生了改变。这些改变的肠道菌群是否影响肝硬化患者的营养状况，目前尚无研究采用宏基因组学分析肠道菌群与营养状况的关系。我们前期研究表明，第三腰椎骨骼肌指数(L3 skeletal muscle index，SMI)预测肝硬化并发腹水患者预后的价值优于传统的营养评估方法，如体质指数(body mass index,BMI)，上臂肌围(upper arm muscle circumference ,MAMC)和三头肌皮褶厚度(triceps skinfold thickness,TSF) {Yao, 2019 #198}。因此，本研究采用L3 SMI评估了肝硬化患者肌量减少及其与肠道微生态的相关性，旨在为干预和提高肝硬化患者的营养状况提供诊疗思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2019年4月～2019年10月山西白求恩医院住院的肝硬化患者60例，男性36例，女性24例；平均年龄(53.5±12.4)岁。其中乙型肝炎肝硬化44例，丙型肝炎肝硬化6例，酒精性肝硬化6例，原发胆汁性肝硬化4例。根据临床资料、血生化指标、影像学资料和肝组织病理学检查等诊断为肝硬化。排除标准：①并发肝癌及其他恶性肿瘤；②并发严重的呼吸和循环系统疾病；③有胃肠道手术史。另选择同期健康体检者30例，男性17例，女性13例；平均年龄为(54.2±11.2)岁，无肝脏和胃肠道疾病史，无高血压和糖尿病等慢性疾病。

1.2 营养状况的评估 选择第3腰椎间盘平面成像，应用影像分析软件(syngo.via Siemens AG)计算第3腰椎平面骨骼肌的横截面积总和，再除以身高的平方(cm2/m2)，即得到L3 SMI。L3 SMI是反映全身骨骼肌质量的重要指标。一些研究将其作为营养不良的诊断标准。我们采用日本肝病学会肌量减少诊断标准，即L3 SMI：女性<38 cm2/m2，男性<42 cm2/m2判定为肌量减少[10]。

1.3 粪便DNA提取 受检者在4周内不应用抗生素或微生态制剂，排除消化道出血者。采集晨起新鲜粪便，置于无菌留便盒，3 h内转入-80℃冰箱冻存。采用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit，根据说明书提取粪便DNA，并用琼脂糖凝胶电泳(AGE)分析DNA的纯度和完整性，采用Qubit精确定量DNA浓度。

1.4 宏基因组测序 根据文库试剂盒[KAPA HyperPlus PCR-free(96rxn)]说明书进行操作。对检测合格的DNA 样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp的片段，经末端修复、加A 尾、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成整个文库制备。在文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至 2 ng/μl，使用普凯瑞qSep 100 对文库的insert size进行检测。当insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>3 nM)，以保证文库质量。在文库检测合格后，进行Illumina HiSeq测序。对所有原始宏基因组测序数据通过MOCAT2软件进行质量质控[11]。对高质量的reads用SOAPdenovo(v2.04，参数：all -D 1 -M 3 -L 500，http://soap.genomics.org.cn) 进行组装，得到scaftigs。基于组装获得scaftigs，用MetaGeneMark进行基因结构预测。对预测后的基因用CD-HIT进行聚类去冗余。当两个基因的序列大于 95%以上一致，并且重叠区域覆盖超过其中短序列的90%以上时，将这两个基因聚到一个簇中，选择簇中最长的序列作为该簇的代表序列，构建基因长度大于100 bp的非冗余基因集；在基因层面上，将高质量reads通过BWA比对到所构建的非冗余参考基因集，去除长度小于30 bp以及一致性低于95%的reads，得到每个基因的reads计数，再经标准化处理，获得基因的相对丰度。在物种及其他高级分类层面上，应用MetaPhlan 2.0获得菌群的相对丰度。

2 结果

2.1 一般资料 健康人BMI为(24.8±4.1)kg/m2，显著大于肝硬化组【(23.7±3.6)kg/m2，P<0.05】；根据L3 SMI指数，将肝硬化患者进一步分为肌量减少组和肌量正常组，匹配年龄和性别后，肌量减少组为24例，肌量正常组为36例，两组临床资料见表1。

2.2 肠道菌群Alpha多样性分析 采用Shannon指数评估入组人员肠道菌群多样性。肝硬化组Shannon指数为(2.3±0.8)，显著低于健康人【(2.7±0.5)，P=0.086】；进一步分析，肌量减少组shannon指数为(2.1±0.8)，显著低于肌量正常组【(2.7±0.8，P=0.048，图1)。

表1 两组肝硬化患者临床资料比较

图1 健康人与肝硬化患者肠道菌群多样性分析

2.3 物种组成分析 在门水平，肝硬化患者粪便菌群中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)仍是肠道菌群中的绝对优势菌，其次是放线菌门(Actinobacteriap)、变形菌门(Proteobacteria)，占全部序列的99%以上。在健康人和肝硬化组，厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门相对丰度分别为57.1%±13.5%和47.9%±16.9%、14.8%±16.9%和8.3%±11.5%，和25.1%±9.2%和36.8%±21.2% (P>0.05)；变形菌门相对丰度为1.7%±1.5%和6.2%±7.9%(P<0.05，图2)；在肌量减少组和肌量正常组，厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门相对丰度分别为43.8%±18.3%和54.5%±12.5%、8.7%±13.2%和7.6%±8.6%，和38.8%±24.6%和33.6%±14.8%(P>0.05)；变形菌门相对丰度为7.7%±9.3%和3.6%±4.1%(P<0.05，图2)；为了分析肝硬化肌量减少组和肌量正常组患者肠道菌群的差异，我们应用非参数Kruskal-Wallis 秩和检验在种水平进行了分析，发现两组之间存在16种相对丰度显著差异的菌种(P<0.05)，其中肌量减少组中相对丰度显著降低的是多形棒状菌(Bacteroides uniforms)、梭杆菌(Clostridium_asparagiform)、毛螺菌 (Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA、Lachnospiraceae_bacterium_7_1_58FAA)、瘤胃球菌(Ruminococcus_flavefaciens)、韦荣球菌(Erysipelotrichaceae_bacterium_2_2_44A)、Granulicella_unclassified、Eggerthella_unclassified、Anaerostipes_hadrus，显著增加的是真杆菌(Eubacterium_infirmum)、消化链球菌(Peptostreptococcus_stomatis)、隶属于拟杆菌属(Bacteroides)的Bacteroides_caccae、Bacteroides_coprocola、Bacteroides_faecis、Weissella_unclassified、Megamonas_unclassified(图3)。进一步，我们把在种水平上有意义的肠道菌群与L3 SMI进行了关联分析(图4)，结果发现两个种的细菌与SMI显著相关，其中Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA(r=0.615，P<0.001)和Bacteroides uniforms(r=0.420，P<0.001)均与L3 SMI呈显著正相关。

3 讨论

本研究利用宏基因组测序方法分析了肌量减少的肝硬化患者的肠道菌群特点。我们发现，相似于既往的研究结果[12-14]，肝硬化患者衡量多样性的shannon指数比健康人略有下降。在门水平，肌量减少的肝硬化患者变形菌门相对丰度明显增高。在种水平，通过非参数Kruskal-Wallis 秩和检验，发现肌量减少组和肌量正常组之间存在16个菌种的差异，进一步通过关联分析发现Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA和Bacteroides uniforms细菌相对丰度与SMI呈显著正相关。

研究表明，与正常人相比，肝硬化患者肠道菌群发生了改变。这些变化的菌群不同程度地影响肝硬化患者的营养状况[15]。本研究肌量减少组肠道菌群多样性比肌量正常组下降，比健康人显著下降，提示肌量减少与肠道菌群的多样性相关。在某些病理状态下肠道微环境可能更有利于某些适合的细菌过度生长，从而表现为多样性下降[16]。相反，在肌肉发达的运动员中肠道菌群的多样性增加。

图2 健康人与肝硬化患者及肝硬化肌量减少组与肌量正常组在门水平菌群差异比较

图3 肌量减少组与肌量正常组在种水平菌群相对丰度比较 种菌群相对丰度以对数标度绘制，方框表示从第一个四分位数到第三个四分位数的四分位数间距(IQR)，内线表示中位数。箱线表示从第一个和第三个四分位数开始的1.5 IQR范围内的最低和最高值。圆代表箱线以外的异常值

图4 肝硬化患者肠道菌群与L3 SMI的相关性分析

在种水平分析，我们发现肌量减少组和肌量正常组肝硬化患者肠道菌群的差异，两组之间存在16种相对丰度明显差异的菌种 (P<0.05)。进一步通过关联分析发现Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA和Bacteroides uniforms与SMI显著相关。Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FA属于毛螺科菌(Lachnospiraceae)，是人类胃肠道微生物群的主要部分，主要用于膳食纤维的发酵，为机体产生有益的物质[18]。Lachnospiraceae菌群的成员与肥胖症和人类结肠癌的预防有关，这主要是因为该菌群的许多成员与丁酸的产生有关[19, 20]，丁酸是一种短链脂肪酸，它的产生会阻止某些微生物在肠道中的生长，刺激产生调节性T细胞，抑制炎症和调节基因表达，同时为机体提供了能量来源。Bacteroides uniforms属于拟杆菌属(Bacteroides)是人类肠道中的共生菌，可以广泛利用饮食和内源性多糖，生产对细菌和宿主都有潜在益处的物质[21]。目前已知，在肠道中，Bacteroides对宿主是有益的[22]。纤维素和半纤维素等不能被胃消化酶直接消化的物质进入到结肠被Bacteroides发酵分解成短链脂肪酸，为机体供给能量[23]。研究表明，Bacteroides uniforms糖酵解能力高于其它Bacteroides species[21]。肌量减少组中Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA和Bacteroides uniforms相对丰度的降低，一方面与丁酸生成量的减少有关，一方面与炎症打破肠黏膜免疫系统的动态平衡有关，两者均影响机体营养物质的吸收，使机体SMI降低。