关于“烟草花叶病毒的感染和重建实验”的几个疑惑点探析

盛国跃

摘要：主要以Fraenkel-Conrat H，Williams R C于1955年发表的《Reconstitution of active tobacco mo-saic virus from Its inactive protein and nucleic acid components》（《活性烟草花叶病毒活性蛋白及核酸成分的重组》）Fraenkel-Conrat H，Singer B于1957年发表的《Virus reconstitution：Ⅱ.Combination ofpro-tein and nucleic acidfrom different strains》（《病毒重组：Ⅱ来自不同品系的蛋白质与核酸的结合》）两篇论文为依据，对学生在学习烟草花叶病毒的感染和重建实验过程中经常产生的三个疑惑点进行探析。

关键词：烟草花叶病毒 病毒感染 病毒重建

中图分类号：Q-49 文献标志码：E

烟草花叶病毒的感染和重建实验是证明核酸是遗传物质的证据链中关键的一环。学生在学习时，经常h会对该实验中的几个操作产生疑惑。其原因有：①在经全国中小学教材审定委员会2004年及2019年初审通过的各个版本高中生物学教材中对这一实验的介绍都很少，如人教版只是简单地说明了实验的结论，苏教版只以“知识海洋”的方式做了简介，浙科版对这一实验的着墨相对较多，但也基本没有提及具体的操作过程。②与生物学教学相关的杂志中，这方面的相关论文也极少，在中国知网上以烟草花叶病毒为关键词，以生物学通报为文献来源进行检索，只搜到3篇论文。下面以浙科版教材为例，对学生经常产生的三个疑惑点进行探析。

1使烟草花叶病毒感染烟草的操作方法

1.1疑惑：如何进行烟草花叶病毒感染烟草的操作

在浙科版高中生物学教材中多次提及“感染”操作，如“用RNA和蛋白质分别去感染烟草”“分别来自不同病毒株系的RNA和蛋白质混合后感染烟草”等。但教材中并未提及“感染”的具体操作方法，在其他章节中也未出现可供参考的内容，这让许多学生对此中产生疑惑。

1.2解析：感染操作采用常规的摩擦接种法

烟草花叶病毒有很多类型，不同类型的侵染方式不同。它们都无特殊的吸附结构，故只能以被动方式侵入，如借助于昆虫的刺吸式口器或植物天然伤口侵入。其中，TMV可通过相邻叶片摩擦形成的轻微伤口入侵。在自然条件下。被烟草花叶病毒侵染后的种子、叶片等是主要侵染源。烟株发生感染的主要时期是苗期至现蕾期，此时烟株抵抗烟草花叶病的能力弱，易感病。在本实验中，使烟草花叶病毒感染烟草的常规方法是摩擦接种。具体的操作是选取生长期、长势相同的烟草若干，在叶片表面喷洒金刚砂，用刷子蘸取病毒液轻轻摩擦，重复几次。接种后，需用清水轻轻冲洗叶片叶面，以利于植株发病。由于TMV发病最适温度为25～27°C，当温度高于38℃后，病毒会受到高温的抑制，因此实验应在20～30°温室内进行。

2将烟草花叶病毒的RNA与蛋白质相互分离的操作方法

2.1疑惑：如何人为地将烟草花叶病毒的RNA与蛋白质相互分离

浙科版教材在“烟草花叶病毒（a、b）及其对叶子细胞的感染和病毒重建（c）”示意图中标出，通过“降解”的方法将TMV的RNA与蛋白质相互分离，但没有写明其降解的具体方法。受酶解法除去植物细胞的细胞壁等知识的影响，多数学生错误地认为在该实验中也是用酶解法进行“降解”的。

2.2解析：用石碳酸处理或碱性洗涤剂处理。可使烟草花叶病毒的RNA与蛋白质相互分离

格勒（Gierer）和施拉姆（Schramm）在进行烟草花叶病毒的感染实验时，采用了将TMV放入水和苯酚（石碳酸）中震荡的方法，将蛋白质和RNA分离（图1）。其基本操作是将TMV溶液与苯酚的水溶液混合，配制调成质量分数为3%的十二烷基硫酸钠（SDS）和物质量浓度为0.3 mol/L NaAc的混合溶液。在4°C下剧烈振荡溶液，离心后取水相，可得到TMV的RNA。

美国加利福尼亚大学的弗伦克尔·康拉特（H.F.Conrat）和威廉姆斯（R.C.Williams）在进行烟草花叶病毒的重建实验时，采用先将TMV用弱碱性洗涤剂处理，然后通过分别提纯的方法将TMV的RNA和蛋白质分离。其基本的操作是在3℃条件下，将TMV溶液置于pH为10～10.5的甘氨酸缓冲液或pH为10.5的碳酸氢盐中透析48～72 h。用冷超速离心法分离除去未降解的病毒，用硫酸铵将上清液调至pH为0.4的饱和液，并再次离心。离心后，TMV的蛋白质主要存在于沉淀中，而RNA主要存在于上清液中。对蛋白质部分进行重新溶解，经在低硫酸铵浓度下沉淀、透析等操作后，可获得纯度高、重组效果好的TMV的蛋白质。

从经碱降解的TMV中提取的核酸组分，其重组效果不如用洗涤剂法提取的核酸组分。洗涤剂法提取核酸的基本操作是将含有SDS质量浓度为1%的病毒溶液的pH调整为8.5，并在40℃下保持16～20 h。用硫酸铵使蛋白质沉淀后，取上清液。将上清液冷藏、离心，并用冷乙醇和pH为5的乙酸盐进一步纯化，可获得重建效果好的TMV的RNA。

3将提纯后的RNA和蛋白质体外重建的操作方法

3.1疑惑：如何实现烟草花叶病毒的体外重建

在浙科版教材中，关于烟草花叶病毒重建操作的相关表述只有一句：“来自不同病毒株系的RNA和蛋白质混合后感染烟草”。至于RNA和蛋白质应该在什么样的环境进行混合，混合后又应置于什么样的环境下等问题都没有说明。这就容易导致学生简单地认为，只要病毒的核酸和蛋白质在细胞外相遇，就可以自发的重建，不需要特殊处理。

3.2解析：体外重建效果受pH和离子强度等因素的影响

TMV结构简单，是一种典型的棒状植物病毒，约由2 130个相同的蛋白亚基沿着单链RNA螺旋状而成，有较强的自组装特性。体外重建的效果受pH和离子强度等因素的影响。弗伦克尔·康拉特和威廉姆斯在进行重建活性病毒时的基本操作是将质量分数为1%的蛋白质溶液与质量分数为0.1%的核酸溶液按一定比例混合，并添加适当的缓冲液，使樣品呈现乳白色。pH为6的醋酸盐作为缓冲剂的效果最好，但磷酸盐（pH为6.3或7.0）和乙酸铵（pH为6）也可使用。将样品置于3℃环境下保存24 h后，进行超速离心，除去不可溶物质，获得乳白色上清液，即可从乳白色上清液中获得有活性的重组病毒。用电子显微镜观察，发现在重建过程中最初形成的是圆盘状、带有中心孔的蛋白质聚集体（图2），最终形成的重组烟草花叶病毒的形态与正常TMV相同，但短片段比例较大（图3）。

由于受到课程的性质、文本的篇幅等因素的限制，高中生物学教材不可能对各种生物学知识都加以详尽的介绍。学生在学习的过程中也难免会出现一些困惑。在学生产生困惑之后，教师应积极地引导学生去解决困惑。解决困惑的有效方法之一是查阅科学家最初发表的相关研究论文。