基于网络药理学预测归肾丸治疗卵巢早衰的作用机制

闫菲， 史云， 赵琦， 王晓梅， 苏先芝， 刘一斐， 韩福国， 刘清飞

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；3.清华大学药学院，北京 100084）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40岁之前出现卵巢功能减弱甚至衰竭，以血清促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，FSH）与黄体生成素（luteinizing hormone，LH）浓度升高和雌二醇（estradiol-2，E2）浓度下降为特征的衰老性疾病[1]。近年来由于社会压力增加、饮食生活习惯改变、环境污染等因素使得卵巢早衰的发病率逐渐升高并呈现年轻化趋势，据统计，其年发病率在1%～3%之间[2]。目前早发性卵巢功能不全临床诊疗指南推荐卵巢早衰治疗主要包括激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）、免疫抑制剂、卵巢冻存和移植、基因治疗、干细胞移植、脱氢表雄酮（DHEA）等[3]。HRT可以维持年轻患者的第二性征，恢复月经样出血，但会增加高危人群卵巢癌、乳腺癌风险[4]。促排卵可辅助生育，但易并发卵巢过度刺激，加速卵巢功能衰竭[5]。而干细胞治疗、靶向基因治疗、卵巢冻存和移植技术复杂，副作用暂不明确，多数尚处在评估安全性的动物实验阶段[6-9]。因此，在临床中找到更有效治疗卵巢早衰疾病的方法，延缓卵巢衰老病程是妇科学领域的重要研究问题。

中医学无卵巢早衰病名，多将其归属“闭经”“月经量少”“年未老经水断”等范畴，肾虚是卵巢早衰发病的重要病因，肝郁脾虚、血瘀是次要病因病机。归肾丸是《景岳全书》中的经典方剂，由熟地黄、山茱萸、杜仲、当归、菟丝子、枸杞子、山药、茯苓等8味中药组成，药味配伍精干练达，具有补阴益阳、养血填精的功效[10]。多项临床研究证明归肾丸能有效改善卵巢早衰患者潮热、盗汗、月经量少等症状[11-12]；相关动物实验表明，归肾丸能显著改善卵巢早衰模型大鼠卵泡功能[13-15]，对卵巢颗粒细胞也具有调整内分泌、抑制凋亡等作用[16-17]。目前，归肾丸治疗卵巢早衰的主要活性成分及作用机制未见系统阐释。网络药理学（network pharmacology）是近年来发展起来的新兴学科，它将中药药理学、高通量生物信息学、高端数据分析软件高度整合，提出了“药物—靶标—病证”的中医药网络药理学研究新理念，为中药药效物质基础、疗效机理研究奠定了科学基础[18]。因此，本研究采用网络药理学方法对归肾丸治疗卵巢早衰的主要成分、关键靶点和信号通路进行挖掘，以期解释其潜在的作用机制而为下一步研究指明方向，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1归肾丸活性成分与潜在靶点筛选采用中药系统药理学分析平台（TCMSP）、中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）、中药分子机制综合数据库（TCMID）检索归肾丸中各味药材的全部化学成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为活性化合物的筛选条件，将3个数据库的成分预测靶点合并，建立归肾丸化学成分—靶点数据集。

1.2卵巢早衰疾病靶点筛选通过在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//www.omim.org/）、人类基因数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org），以“premature ovarian failure”为关键词检索卵巢早衰的相关靶点，建立卵巢早衰疾病靶点数据集。将成分靶点数据集和疾病靶点数据集取交集，获得归肾丸—卵巢早衰疾病的共同靶点，并进行药物成分靶点—卵巢早衰疾病靶点映射，利用Cytoscape 3.6.1软件构建“活性成分—作用靶点”网络，药物活性成分和作用靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。

1.3蛋白质—蛋白质相互作用（PPI）网络的构建将归肾丸—卵巢早衰共同作用靶点导入STRING（https：//string—db.org/）数据库中，以置信度分数score≥0.700（高置信度）为条件进行筛选，并隐藏网络中无联系的节点，余参数不变，将得到的结果以文本形式导入CytoScape 3.6.1软件中进行可视化，获得蛋白质相互作用网络。

1.4基因本体论（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析利用David 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对归肾丸和卵巢早衰疾病共同作用靶点蛋白进行GO生物功能和KEGG信号通路富集分析。GO生物功能分析主要用于描述基因靶点的功能，包括细胞功能、分子功能和生物功能3部分。KEGG富集分析可以得到归肾丸和卵巢早衰疾病共同靶点所富集的信号通路。GO和KEGG分析均以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1归肾丸活性成分与潜在靶点筛选通过在TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID平台检索，并将3个数据库筛选结果合并，共获得归肾丸活性成分162个，其中熟地黄2个，山药18个，山茱萸23个，茯苓16个，当归6个，杜仲42个，枸杞子43个，菟丝子12个，共预测潜在靶点829个。

2.2卵巢早衰疾病靶点筛选在OMIM、Gene Cards数据库检索，并结合相关文献共得到与卵巢早衰疾病相关的靶点4 854个。将药物靶点和疾病靶点取交集，共得到AKT1、CASP3、CASP8、CASP9、FAS、EGF等152个共同靶点。

2.3“成分—靶点—疾病”网络构建将归肾丸活性成分与卵巢早衰关键靶基因及相关对应关系以及属性导入到CytoScape，建立“成分—靶点—疾病”网络，见图1。使用CentiScape计算活性成分中心性（Degree Centrality，DC）。一个节点DC越大，说明节点在网络中越重要。DC结果槲皮素（quercetin）为88，豆甾醇（stigmasterol）为36，山萘酚（kaempferol）为33，β-胡萝卜素（beta-carotene）为15，表儿茶素（ent-epicatechin）为14，分别位于前5位，见表1。

2.4 PPI网络的构建将152个共同靶点导入STRING中，选择高置信度0.700，下载PPI.tsv文件导入到CytoScape，得到151个PPI网络基因。其中TP53、AKT1、MMP9、ASP3、IL6位于核心基因位置。结果如图2、3。

图1归肾丸治疗卵巢早衰“化合物—靶点”图Figure 1 “Component-target”network of Guishen Pills in treating POF

表1 归肾丸活性成分以及OB、DL（DC数前10位）Table 1 Information of active ingredients in Guishen Pills and their OB，DL（top 10 DC）

图2 归肾丸治疗卵巢早衰潜在靶标相互作用网络Figure 2 The interaction network of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

图3 归肾丸治疗卵巢早衰前10位潜在靶标的互作网络图Figure 3 The interaction network of top10 candidate targets from Guishen Pills in treating POF

2.5归肾丸—卵巢早衰—基因的生物学过程根据显著性程度P值由小到大进行展示，GO分析结果提示归肾丸—卵巢早衰—基因的生物过程（BP）显著富集含氧化合物反应、细胞对化学刺激的反应、化学反应、对有机物的反应、对有机循环化合物的反应；在分子功能（MF）主要富集在酶结合、信号受体结合、分子功能监管、相同蛋白结合、激酶结合上；细胞组分（CC）主要富集在细胞外空间、细胞外区域、膜筏、膜区域上。见图4～6。

2.6归肾丸—卵巢早衰—基因的生物学通路KEGG富集分析得到富集后信号通路133条，删除与“cancer”相关的通路，并结合相关文献进行筛选，根据校正后P值进行排序，筛选前30条进行气泡图绘制。结果显示，相关信号通路包括肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、凋亡相关信号通路、叉头框转录因子O亚族（FoxO）信号通路、Toll样受体信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。见图7、8。富集前10位细节见表2。

图4 归肾丸治疗卵巢早衰的潜在靶标的BP分析Figure 4 Biological processes of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

图5 归肾丸治疗卵巢早衰的潜在靶标的CC分析Figure 5 Analysis for cellular components of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

图6 归肾丸治疗卵巢早衰潜在靶标的MF分析Figure 6 Analysis for molecular functions of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

3 讨论

图7 前30位KEGG通路富集气泡图Figure 7 Bubble map for top 30 KEGG pathways enrichment

图8 归肾丸治疗卵巢早衰“成分—靶标—通路”网络关系图Figure 8“Component-target-pathway”network of Guishen Pills in treating POF

3.1归肾丸组方分析卵巢早衰的病因病机总以肾虚为主导，即所谓“经水出诸肾”“肾水本虚，何能盈满化经水而外泄”。归肾丸方中重用熟地黄以填精益髓，山茱萸、杜仲、当归滋阴养血促进卵泡生长，菟丝子、枸杞子温阳益气，促进成熟卵泡排出，山药、茯苓健脾培补后天以资先天。全方共奏补阴益阳、养血填精功效。

3.2归肾丸活性成分分析通过分析得到归肾丸治疗卵巢早衰的活性成分有162个，包括槲皮素、大豆黄素、山萘酚、表儿茶素、豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇等。其中，槲皮素、大豆黄素、山萘酚是黄酮类化合物，具有很好的抗炎、抗氧化应激等卵巢保护作用。有研究表明，槲皮素能够增加自身免疫性卵巢早衰小鼠生长卵泡和成熟卵泡的比例，降低自身免疫性卵巢炎[19]，还具有一定的促进卵巢卵泡发育和成熟的作用而不影响卵巢寿命[20]。表儿茶素可以提高小鼠卵母细胞的mtDNA拷贝数及其发育潜能[21]。豆甾醇、谷甾醇均属于植物甾醇，对去卵巢小鼠内源激素不平衡状况可以明显改善，而β-谷甾醇可明显促进卵巢颗粒细胞分泌雌激素E2[22]。因此，可推测以上化合物是治疗卵巢早衰的核心化合物。

表2 归肾丸治疗卵巢早衰KEGG通路富集前10位细节表Table 2 Data of top 10 KEGG pathways enrichment

3.3关键靶点分析通过对归肾丸治疗卵巢早衰的PPI网络分析，其中AKT1、CASP3、MMP9、IL-6位于核心基因位置。AKT1是P13K/AKT信号通路的重要组成部分，在细胞生存和生长调控中起到重要作用。研究表明，将AKT1从小鼠原代颗粒细胞中去除后从转录组学及蛋白组学中评估其分子后果，发现AKT1不仅在细胞新陈代谢、凋亡、细胞周期、细胞肌动蛋白骨架调控中具有重要作用，在DNA修复、胞内运输和线粒体功能上也有显著改变[23]。CASP3是凋亡家族Caspase家族的明星蛋白，在卵巢生殖细胞和卵巢颗粒细胞中，CASP和Bcl2基因家族组成了促凋亡和抗凋亡易感基因[24]。卵泡闭锁是导致卵巢储备池过早衰竭的重要原因，而颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁所必须的，参与颗粒细胞凋亡的主要死亡受体配体系统是FAS和FASL系统，其后的细胞内信号激活Caspase 3导致DNA断裂从而引起卵泡闭锁[25]。MMP9是基质金属蛋白酶（MMP）家族的重要组成成分，MMPs及其组织抑制剂（Timps）被广泛认为是卵巢细胞外基质重构的关键因子，在动情周期中参与卵泡生长、排卵、黄体化和黄体溶解[26]。有研究表明，通过qRT-PCR检测出哺乳动物的MMP9的mRNA在原始卵泡中含量最低，在早期卵泡中可检测到峰值水平，而且在所有卵泡期的颗粒细胞中有特异性的高浓度的表达，说明MMPS家族，尤其是MMP9在卵泡腔的形成和扩张中起到了重要作用[27]。女性排卵一直被认为是复杂的炎症反应过程，卵巢内或周围的免疫细胞和促炎因子的改变都会对生殖功能产生深远影响[28]。IL-6属于是典型的免疫反应调节因子。研究表明，IL-6在体内外均可以调节胎鼠生殖细胞的存活、增殖和分化，并通过实验验证IL-6及其受体在人类胎儿卵巢中表达，并在生殖细胞的多个成熟阶段发育过程中起到关键作用[29]。

3.4归肾丸治疗卵巢早衰核心信号通路分析通过查阅文献，KEGG富集结果中TNF信号通路、FoxO信号通路、凋亡相关信号通路、PI3K/AKT信号通路等与卵巢早衰密切相关。卵巢排卵是一个复杂的生物过程[30]，而TNF信号通路是核心炎症信号通路，TNF-α可通过发挥炎症作用从而影响卵巢颗粒细胞通过自分泌和/或旁分泌机制来调节卵泡成熟和排卵[31]，在卵巢衰老[32]，颗粒细胞凋亡[33]、增殖[34]和分化[35]中均发挥重要作用。Fox是“Forkhead box”的缩写，是根据在果蝇Fkh突变体中观察到的异位头结构而命名的，是Fox蛋白转录因子的超家族，参与寿命、抗应激、凋亡、细胞增殖、分化和代谢等多种生命体过程，在卵巢功能中也发挥了强大的调节作用[36]。其亚家族中研究比较多的主要包括FoxO3、FoxO4、FoxO6。FoxO3是目前研究最多，与卵巢中卵泡激活与卵巢功能密切相关的，有研究表明，FoxO3表达和哺乳动物的原始和初级卵泡密切相关[37]，当FoxO3被调控，小鼠的生殖周期显著延长[38]。说明FoxO3蛋白可以作为一种调节因子，抑制原始卵泡的过度激活，增加卵巢储备，从而延长女性生育周期[39]。凋亡信号通路是当前研究较为热门的信号通路。Caspases家族如Caspase-3、Caspase-8是细胞内半胱氨酸蛋白酶家族的代表，有研究表明其作用与几乎所有哺乳动物细胞凋亡的起始和终末阶段都有联系，其他如Bcl2家族、cAMP家族、PI3K/AKT通路都与Caspases级联蛋白水解活性相互作用，而其他几种内分泌和旁分泌调节分子也在调节颗粒细胞凋亡中发挥作用，如转化生长因子α、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子可以抑制细胞凋亡[40]。PI3K/AKT信号通路是许多正常细胞过程（包括细胞增殖、存活、生长、运动、细胞骨架重排和代谢）的关键调控因子[41]，越来越多的文献证据证明，该通路是卵巢功能的关键调节因子，包括原始卵泡的休眠和激活、卵母细胞的维持和激活及减数分裂以及颗粒细胞和膜细胞的增殖和分化。各种因素导致的信号通路异常都可能导致原始卵泡耗竭从而导致不孕、卵巢早衰和原发性闭经[42]。通路的中间蛋白可以通过抑制BAX、BAD、Forkhead、p53等促凋亡蛋白，激活Bcl2等抗凋亡蛋白，进而促进细胞存活[43]，此外还可通过间接稳定cyclingD1和Myc等蛋白调控细胞周期进展。

综上所述，归肾丸治疗卵巢早衰的作用机制与炎症反应、氧化应激和凋亡等途径相关。本研究基于网络药理学依靠数据库信息在理论层面进行了初步探索，今后还需通过细胞与动物实验进行进一步验证。此外，目前的研究尚存在成分含量、相互作用以及体内代谢过程等因素的影响，今后尚需对归肾丸治疗卵巢早衰功效的物质基础和药效作用机制进行深入研究，以提高临床用药的合理性和科学性。