亚临界水提取芦苇多酚的工艺优化及抗氧化性能研究

刘莎

巴音郭楞职业技术学院，新疆 库尔勒 841000

芦苇为多年生草本植物，是一种在水陆交错带中易生存的禾本科芦苇属植物，它繁殖能力强，具有极高的产量[1]。在水生植物的应用中，芦苇也是当今国际公认的挺水植物优势品种[2]。我国芦苇资源丰富，主要分布在东北三江平原、黄河三角洲、新疆、河北白洋淀等地区[3]。其中,新疆博斯腾湖中生长的芦苇有籍可查就有两千多年的历史，博斯腾湖芦苇产区也是我国四大芦苇产区之一[4]，该地区产出的芦苇光热条件好、光照时间长、早晚温差大，芦苇粗长[5]。然而一直以来芦苇传统的应用领域主要集中在造纸、建筑等方面[6]，其实芦苇也是很好的药食同源植物，传统中医认为芦根具有养阴、清热、利尿的解毒功能[7]，此外芦苇体内所含的活性类物质还有较好的保健功效[8-10]。

植物多酚为单宁的前体化合物以及聚合物，它主要分为水解单宁和缩合单宁等，广义上还包括小分子酚类化合物，如花青素、儿茶素、没食子酸等天然酚类[11-12]。多酚是植物中重要的次生代谢产物，多酚类物质可以通过提供氢原子或螯合剂来抑制氧化作用，这一作用，使其具有较强的抗氧化能力和清除自由基能力[13]。近年来，多酚类物质的抗氧化性及其与小分子的协同抗氧化性能也备受关注[14]，其实多酚物质除了具有抗氧化作用以外，还具有抑菌、抗癌等功效，因此植物多酚也被广泛用于食品、药品等诸多领域。

近年来，随着现代中药的不断发展，多酚类物质的提取工艺也不断被优化。除了常见的溶剂提取法以外，超声波提取、微波辅助提取以及脉冲电场等技术也被广泛运用[15]。亚临界水提取法是一种绿色、无化学溶剂残留的高效提取方法，被应用于众多中药、植物、食品中具有生物活性物质的提取[16]。水在亚临界状态下会随着温度的变化由强极性向非极性过渡，这样一种连续的过程势必较大程度地提取出活性目标物质[17]，近些年该技术广泛应用于植物多酚的提取。本文旨在利用亚临界水提取法找寻博斯腾湖中芦苇多酚类物质的最佳提取工艺，并对其提取物进行抗氧化活性的初探。

1 材料

1.1 仪器

5300PC型紫外-分光光度计(上海元析仪器有限公司)；BS210S型电子天平(德国赛多利斯)；HH-SA超级恒温水浴(金坛市医疗仪器厂)；CSF-1A超声波发生器(上海超声仪器厂)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DHP-420电热恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器厂)；水热反应釜(上海贝伦仪器厂)。

1.2 试药

芦苇2017年10月采自新疆博斯腾湖畔及焉耆包儿海乡开来提村，由巴音郭楞职业技术学院孙红艳副教授鉴定为正品。

没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-200803)；乙醇、甲醇、丙酮、福林-酚试剂、无水碳酸钠、邻二氮菲、H2O2、FeSO4·7H2O、Na2HPO4、NaH2PO4(分析纯)；二苯代苦味酰肼自由基(DPPH·，Sigma-Aldrich 公司)。

2 方法

2.1 样品的预处理

将预晒干的芦苇杆和叶分别在70 ℃下烘5 h后，粉碎并过80目筛，继而避光干燥的环境中保存。

2.2 提取实验

称取1.0 g芦苇叶分别以50 mL甲醇、乙醇(95%)、乙醇(50%)、丙酮为提取溶剂，提取温度40 ℃，超声频率为30 kHz下提取30 min，减压抽滤并定容至100 mL容量瓶中待测。

称取0.5 g芦苇叶放入25 mL水热反应釜中，加入15 mL蒸馏水，待烘箱温度升至180 ℃时将反应釜放入烘箱预热5 min后开始计时。反应2 h后，取出反应釜水冷20 min减压抽滤，并定容至100 mL容量瓶中待测。

分别对亚临界提取方法中的温度、料液比、时间3个因素进行单因素及正交试验优化。

2.3 定量实验

真空干燥至恒重的没食子酸为对照品，移取质量浓度分别为0.86、17.72、35.44、53.16、70.88、88.6 μg·mL-1的溶液1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入1 mL去离子水，0.5 mL福林-酚试剂，混匀静置5 min，加入26.7%Na2CO3溶液1.5 mL。室温避光待反应2 h后于760 nm下测定吸光度[18]。

2.4 抗氧化实验

以甲醇为溶剂配制成浓度为0.04 mg·mL-1的DPPH·溶液，取1 mL样品于试管中，加入3 mL DPPH·溶液，常温避光放置40 min后，于517 nm处测其吸光度(A样)(空白对照组用1 mL甲醇代替样品)测其吸光度(A空)[19]。DPPH·清除率按公式(1)计算。

E=[1-A样/A空]×100%

(1)

取0.75 mmol·L-1邻二氮菲溶液1 mL于比色管中，依次加入PBS液2 mL、蒸馏水1 mL，混匀后加0.75 mmol·L-1硫酸亚铁液1 mL，0.01% H2O21 mL，在37 ℃下反应60 min，于536 nm处测其吸光度(AP值)；以1 mL蒸馏水代替AP值实验过程中的1 mL H2O2(AB值)；以1 mL试样液代替AP值实验过程中的1 mL蒸馏水(AS值)[20]。·OH清除率按公式(2)计算。

d=[(AS-AP)/(AB-AP)]×100%

(2)

2.5 统计分析

实验数据采用Excel 2007及Origin 8.0软件处理。

3 结果讨论

3.1 福林酚测定多酚方法的标准曲线

以吸光度为纵坐标，没食子酸质量浓度(μg·mL-1)为横坐标进行线性拟合，所得标准曲线方程为Y=0.010X+0.066 27，线性范围8.86～88.6 μg·mL-1，r=0.999 2(n=6)。

3.2 提取溶剂对多酚提取率的影响

不同提取溶剂对多酚提取率的影响见图1。

图1 不同溶剂对多酚提取率的影响

由图1可知，亚临界水对芦苇多酚的提取率与实验所选有机及复配溶剂提取率较为接近。但考虑到亚临界水提取法无毒、无溶剂残留、提取效率高、能耗低、适合食品及药品生产等诸多优势[21]，因此本文着重优化了亚临界水提取芦苇多酚的工艺条件。

3.3 单因素试验

3.3.1料液比对提取率的影响 由图2可知，多酚提取率随着料液比的减小整体呈现上升趋势，其中在1∶10～1∶40上升速率最快，而越过1∶40上升趋势趋于平缓，但考虑到料液比继续减小会给后期浓缩带来较大的工作量，因此料液比初选为1∶40。

图2 料液比对多酚提取率的影响

3.3.2温度对提取率的影响 见图3。

图3 温度对多酚提取率的影响

由图3可知，多酚提取率随着反应温度的升高整体呈现上升趋势，其中在140～160 ℃上升速率最快，而越过180 ℃提取率基本维持不变，考虑到温度继续加大会使得工艺能耗加大，因此温度初选为180 ℃。

3.3.3时间对提取率的影响 见图4。

图4 时间对多酚提取率的影响

由图4可知，提取时间越长多酚的提取率升高，这是一个累积的过程。其中在60 min后提取率变化较为平缓，但考虑到到溶出时间加长可能会增加杂质的溶出量，这样会给后期的纯化带来较大工作量，综合分析提取时间初选为60 min。

3.3.4正交试验结果 根据单因素试验结果选定了一定范围的提取温度、提取时间及料液比L9(34)正交表进行试验，结果见表1。

表1 亚临界水水提取芦苇多酚工艺正交试验结果

由表1数据可知，在选定的因素范围之内，影响芦苇提取率最大的因素为反应温度，其次为反应时间，再次为料液比。其中反应温度越高、反应时间越长、料液比越大越有利于多酚的溶出。经过正交试验极差分析，发现优化工艺条件为浸提温度200 ℃、料液比1∶30、浸提时间为120 min，而试验组合中最佳工艺条件确为浸提温度200 ℃、料液比1∶40、浸提时间为120 min。经过分析两者结果略有差异，为了确定最优的工艺条件，还应进一步进行料液比的验证实验。因此，在浸提温度200 ℃、浸提时间为120 min的条件下，实验又测定了料液比为1∶30和1∶40时的多酚提取率，结果显示当料液比为1∶30时，提取率为(3.87±0.02)%；当料液比为1∶40时，提取率为(4.16±0.06)%。

从结果分析，料液比1∶40的提取率明显高于1∶30，由此确立最佳料液比为1∶40。因此最优提取工艺条件为浸提温度200 ℃、料液比1∶40、浸提时间为120 min。

3.3.5放大试验结果 放大试验是在提取温度200 ℃、提取时间120 min、料液比1∶40的最优提取条件下将物料放大100倍完成的测定。结果显示，放大试验的多酚提取率为(3.53±0.02)%。

经对比，放大试验的提取率小于原试验提取率，原因可能在于物料增多后静置反应容器反应可能不均匀，导致未能高效地提取多酚。后期可通过振荡或超声、微波辅助预处理等手段加以提高。

3.3.6水、陆生芦苇叶、茎多酚的测定结果比较 在已优化的最优提取工艺条件下，分别以水生芦苇叶、茎及陆生芦苇叶、茎4种原料为试材，测定其多酚含量依次：水生芦苇叶4.22%、水生芦苇茎3.36%、陆生芦苇叶3.50%、陆生芦苇茎3.49%。水生芦苇叶中多酚含量明显高于其他3种试材。

3.3.7芦苇叶、茎抗氧化实验结果 在已优化的最优提取工艺条件下，分别提取了以水生芦苇叶、茎及陆生芦苇叶、茎4种原料的多酚试样，进行了·OH和DPPH·自由基的清除能力测定，结果见表2，

表2 ·OH和DPPH·自由基的清除能力 %

结果可知，在相同提取工艺条件下，水生芦苇叶中多酚含量明显高于水生芦苇茎中多酚含量，同时也高于陆生芦苇植株中叶、茎中多酚的含量，而陆生芦苇植株叶、茎多酚含量无明显差异。水生芦苇叶清除自由基的能力明显高于其他3个样品，特别是在清除DPPH·实验中有着绝对的优势，而清除·OH的能力也与多酚总量的大小有着密切关系(r为0.939 3)。此外陆生芦苇叶、茎中多酚含量相差无几，但清除DPPH·却存在很大差异，这应该是由于植株不同部位多酚种类的差异性带来的结果。

4 结论

通过单因素及正交试验，亚临界水提取法在芦苇叶多酚的提取过程中对工艺影响因素的大小依次为浸提温度>浸提时间>料液比。最终筛选的最优工艺条件为浸提温度200 ℃、料液比1∶40(g∶mL)、浸提时间为120 min，在此优化条件下多酚提取率可达4.22%。

通过2种不同的抗氧化能力测定体系，选择了水、陆生植株的叶、茎部位进行抗氧化实验，结果表明，不同样品的多酚提取物均能对·OH和DPPH·自由基有一定的清除能力，特别是在清除·OH的实验中，清除能力与总多酚含量有明显的量效关系，即多酚含量越高清除能力越强。此外，在相同的提取工艺下，水生芦苇叶中的多酚含量较其他样品有绝对的优势，并且在相同浓度下，对DPPH·的清除能力也是最强的。而比较了陆生芦苇中叶与茎多酚提取物的清除DPPH·能力后，也发现芦苇叶多酚提取物的效果更佳，同等浓度下，叶多酚的清除率可达茎多酚清除率1.9倍，这可能是两部分的多酚种类存在较大差异的结果。综合以上结果，芦苇多酚提取物，可作为较好的天然抗氧化剂来源被加以利用。